论文部分内容阅读
摘 要：建立饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定方法。试样用磷酸盐缓冲溶液提取，经固相萃取小柱净化，氮气吹干后用溶解待测。采用LC-MS/MS测定，色谱柱为C8反相色谱柱，流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，电喷雾正离子模式电离，多反应选择离子检测（MRM），外标法定量。结果表明方法可用于饲料中恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星的同时测定。。
关键词：饲料；液相色谱-串联质谱；恩诺沙星；环丙沙星；诺氟沙星；多反应监测 【中图分类号】TS214.2 【文献标识码】A
Abstract：To establish a liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）method was developed for determinations of enrofloxacin，ciprofloxacin and norfloxacin in Feeds.enrofloxacin，ciprofloxacin and norfloxacin were extracted by sonication with Phosphat buffer solution.By the SPE cartridge and nitrogen dry，the extracts were dissolved.The separations were performed on a C8 reversephase columnusing acetonitrile-0.1%formic acid as the mobile phase.The analysis was carried out under positive ESI MS/MS and multiple reaction monitoring mode （MRM）.The method was proved to be simpl and accurate.
Key words：Feeds；Liquid chromatography-mass spectrometry；Enrofloxacin，Ciprofloxacin；Norfloxacin；Multiple reaction monitoring
恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星属于喹诺酮类药物，由于其具有抗菌谱广、杀菌活性强、毒副作用小及敏感微生物的最小抑菌浓度低等优点，被广泛应用于各种动物感染性疾病的预防和治疗。但有一部分生产者将其应用到饲料产品中，起到抑菌杀菌的作用。如果动物食用这种饲料会造成一定的危害，产生耐药性或一些毒副作用。因此，建立快速准确地测定饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的方法，对于加强饲料产品监管具有重要意义。
本文建立的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）快速准确地测定饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的方法，可满足检测要求，为饲料产品监督检验提供技术依据。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
Agilent 1200LC/-6410B MS液相色谱/串联四极杆质谱仪（安捷伦科技有限公司）；BS224S电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；HYQ-2110液体混匀器（苏州捷美电子有限公司）；KQ-250DE超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）；Microfuge离心机（美国BECKMAN公司）。
恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星标准品，纯度>98%（美国SIGMA公司）；乙腈、甲酸为色谱纯（Burdick&Jackson公司）；无水乙醇（分析纯，天津市化学试剂有限公司）；样品购自本地超市。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制
分别精确称取恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星0.005g于50mL容量瓶中，然后用甲醇溶解并稀释至刻度，于冰箱4℃以下避光保存。用流动相液将恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星储备液液稀释成10μg/mL的工作液。
1.2.2 样品处理
称取试样0.5g（精确至0.1mg）于50mL具塞离心管中，准确加入6mL磷酸盐缓冲溶液，涡旋混匀，再加入10mL乙腈，于涡旋振荡器振荡提取1min，5000r/min离心5min，上清液过滤到鸡心瓶中，在残渣中加入5mL磷酸盐缓冲溶液，10mL乙腈，重复以上步骤，合并上清液，于50℃旋转蒸发，至乙腈全部蒸出。加入5mL磷酸盐缓冲溶液，混匀。
固相萃取小柱先用5mL甲醇、5mL水和5mL磷酸盐缓冲溶液活化，保持柱体湿润。将样液以1mL/min的流速全部过HLB固相萃取小柱，待液体完全流出后，先后以4mL水，4mL甲醇水溶液淋洗，抽干，用4mL氨水甲醇溶液洗脱于10mL具刻度离心管中，洗脱液于50℃，氮吹至约0.2mL时停止浓缩，用甲醇-甲酸溶液定容至1mL，5000r/min离心5min，过0.2μm滤膜，供液相色谱串联质谱分析。
1.2.4 仪器参数和测定条件
液相色谱条件：C8反相色谱柱（C82.1mm×50mm id，5μm）；柱温：30℃；流速：0.5mL/min；进样量：5μL；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（15+85）。
质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；喷雾压力：35psi；干燥气流速：8mL/min；离子化温度：340℃。
2 结果与分析
2.1 样品提取方法的选择
喹诺酮类药物的化学结构中有羧基和哌嗪基，属于酸碱两性化合物，在酸性和碱性溶液中有较好的溶解性。因此尝试用磷酸盐缓冲液进行提取，此时待测物以负离子形式存在，过固相萃取小柱后就富集在了小柱上，然后再用酸化甲醇进行洗脱[1-4]。 2.2 色谱条件的优化
在一定的流动相条件下，喹诺酮类药物在小粒径的C18色谱柱上都有较好的保留，选择实验室常用的C8柱（50mm×2.1mm）。应用反相色谱条件时，LC-MS/MS分析方法应用的有机相主要为甲醇和乙腈，喹诺酮类药物在甲醇中的信号要比在乙腈中高，选用乙腈作为有机相时，待分析组分的色谱行为较好。实验发现甲酸的加入会抑制其信号，甲酸体积分数越高抑制信号越严重，但考虑到能够改善峰形，使待测物与内源性物质充分分离，所以选择了0.1%的甲酸作为水相（见图1）。
2.3 质谱条件的优化
对质谱条件进行优化，尽可能的使待测物响应信号达到最高。在优化过程中比较恩诺沙星在正、负两种离子化方式的响应值，发现正离子化效率远远高于负离子，正离子响应值高，因此选择了正离子扫描方式。采用Product扫描的方式选择特征离子，逐步加大诱导碰撞能量，随着母离子的丰度逐渐减少，子离子的丰度逐渐增加，分别选用丰度最大的两个子离子作为定量和辅助定性离子，并确定其最佳碰撞能量值，在Product方式中进一步调整碰撞能量，以便获得最大灵敏度（见表1，图2-4）。
2.4 线性与检出限
取阴性样品，依次加入适量待测物质标准系列溶液，在液相色谱-串联质谱设定条件下分别进样，以标准与内标物峰面积比值为纵坐标，工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星检出限为10μg/kg。
2.5 方法的回收率和精密度
根据GB/T 5009.1-2003，我们选取1种空白饲料样品，分别加入50μg/kg水平的三种喹诺酮药物，按照样品处理方法及相同的色谱条件下，进行回收率的测定，每个样品重复3次，计算出每个添加水平的回收率（结果见表2）。
3 结论
本文建立了饲料中恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星的高效液相色谱—串联四极杆质谱联用测定方法，该法具有样品处理简单、测定周期短等优点，适用于大量样品的快速筛选、测定。
参考文献
[1] 谢东华，俞雪钧，殷居易，倪梅林.高效液相色谱-质谱联用法检测烤鳗中环丙沙星[J].理化检验-化学分册，2008（44）5：402-408.
[2] 张翠英，徐金玲，王雪芹，安华民.超高效液相色谱- 串联质谱法检测盐酸洛哌丁胺胶囊中混入诺氟沙星的研究[J].中国药房，2008（19）7：537-539.
[3] 崔相勇，张凤清，周长民，王岩松，钟启智.高效液相色谱-质谱联用法测定豆芽中恩诺沙星含量[J].食品科学，2012（33）20：180-183.
[4] 李小玲，黄向荣，万译文，陈湘艺.高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星[J].中国渔业质量与标准，2013（3）4：25-30.
关键词：饲料；液相色谱-串联质谱；恩诺沙星；环丙沙星；诺氟沙星；多反应监测 【中图分类号】TS214.2 【文献标识码】A
Abstract：To establish a liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）method was developed for determinations of enrofloxacin，ciprofloxacin and norfloxacin in Feeds.enrofloxacin，ciprofloxacin and norfloxacin were extracted by sonication with Phosphat buffer solution.By the SPE cartridge and nitrogen dry，the extracts were dissolved.The separations were performed on a C8 reversephase columnusing acetonitrile-0.1%formic acid as the mobile phase.The analysis was carried out under positive ESI MS/MS and multiple reaction monitoring mode （MRM）.The method was proved to be simpl and accurate.
Key words：Feeds；Liquid chromatography-mass spectrometry；Enrofloxacin，Ciprofloxacin；Norfloxacin；Multiple reaction monitoring
恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星属于喹诺酮类药物，由于其具有抗菌谱广、杀菌活性强、毒副作用小及敏感微生物的最小抑菌浓度低等优点，被广泛应用于各种动物感染性疾病的预防和治疗。但有一部分生产者将其应用到饲料产品中，起到抑菌杀菌的作用。如果动物食用这种饲料会造成一定的危害，产生耐药性或一些毒副作用。因此，建立快速准确地测定饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的方法，对于加强饲料产品监管具有重要意义。
本文建立的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）快速准确地测定饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的方法，可满足检测要求，为饲料产品监督检验提供技术依据。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
Agilent 1200LC/-6410B MS液相色谱/串联四极杆质谱仪（安捷伦科技有限公司）；BS224S电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；HYQ-2110液体混匀器（苏州捷美电子有限公司）；KQ-250DE超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）；Microfuge离心机（美国BECKMAN公司）。
恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星标准品，纯度>98%（美国SIGMA公司）；乙腈、甲酸为色谱纯（Burdick&Jackson公司）；无水乙醇（分析纯，天津市化学试剂有限公司）；样品购自本地超市。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制
分别精确称取恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星0.005g于50mL容量瓶中，然后用甲醇溶解并稀释至刻度，于冰箱4℃以下避光保存。用流动相液将恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星储备液液稀释成10μg/mL的工作液。
1.2.2 样品处理
称取试样0.5g（精确至0.1mg）于50mL具塞离心管中，准确加入6mL磷酸盐缓冲溶液，涡旋混匀，再加入10mL乙腈，于涡旋振荡器振荡提取1min，5000r/min离心5min，上清液过滤到鸡心瓶中，在残渣中加入5mL磷酸盐缓冲溶液，10mL乙腈，重复以上步骤，合并上清液，于50℃旋转蒸发，至乙腈全部蒸出。加入5mL磷酸盐缓冲溶液，混匀。
固相萃取小柱先用5mL甲醇、5mL水和5mL磷酸盐缓冲溶液活化，保持柱体湿润。将样液以1mL/min的流速全部过HLB固相萃取小柱，待液体完全流出后，先后以4mL水，4mL甲醇水溶液淋洗，抽干，用4mL氨水甲醇溶液洗脱于10mL具刻度离心管中，洗脱液于50℃，氮吹至约0.2mL时停止浓缩，用甲醇-甲酸溶液定容至1mL，5000r/min离心5min，过0.2μm滤膜，供液相色谱串联质谱分析。
1.2.4 仪器参数和测定条件
液相色谱条件：C8反相色谱柱（C82.1mm×50mm id，5μm）；柱温：30℃；流速：0.5mL/min；进样量：5μL；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（15+85）。
质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；喷雾压力：35psi；干燥气流速：8mL/min；离子化温度：340℃。
2 结果与分析
2.1 样品提取方法的选择
喹诺酮类药物的化学结构中有羧基和哌嗪基，属于酸碱两性化合物，在酸性和碱性溶液中有较好的溶解性。因此尝试用磷酸盐缓冲液进行提取，此时待测物以负离子形式存在，过固相萃取小柱后就富集在了小柱上，然后再用酸化甲醇进行洗脱[1-4]。 2.2 色谱条件的优化
在一定的流动相条件下，喹诺酮类药物在小粒径的C18色谱柱上都有较好的保留，选择实验室常用的C8柱（50mm×2.1mm）。应用反相色谱条件时，LC-MS/MS分析方法应用的有机相主要为甲醇和乙腈，喹诺酮类药物在甲醇中的信号要比在乙腈中高，选用乙腈作为有机相时，待分析组分的色谱行为较好。实验发现甲酸的加入会抑制其信号，甲酸体积分数越高抑制信号越严重，但考虑到能够改善峰形，使待测物与内源性物质充分分离，所以选择了0.1%的甲酸作为水相（见图1）。
2.3 质谱条件的优化
对质谱条件进行优化，尽可能的使待测物响应信号达到最高。在优化过程中比较恩诺沙星在正、负两种离子化方式的响应值，发现正离子化效率远远高于负离子，正离子响应值高，因此选择了正离子扫描方式。采用Product扫描的方式选择特征离子，逐步加大诱导碰撞能量，随着母离子的丰度逐渐减少，子离子的丰度逐渐增加，分别选用丰度最大的两个子离子作为定量和辅助定性离子，并确定其最佳碰撞能量值，在Product方式中进一步调整碰撞能量，以便获得最大灵敏度（见表1，图2-4）。
2.4 线性与检出限
取阴性样品，依次加入适量待测物质标准系列溶液，在液相色谱-串联质谱设定条件下分别进样，以标准与内标物峰面积比值为纵坐标，工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星检出限为10μg/kg。
2.5 方法的回收率和精密度
根据GB/T 5009.1-2003，我们选取1种空白饲料样品，分别加入50μg/kg水平的三种喹诺酮药物，按照样品处理方法及相同的色谱条件下，进行回收率的测定，每个样品重复3次，计算出每个添加水平的回收率（结果见表2）。
3 结论
本文建立了饲料中恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星的高效液相色谱—串联四极杆质谱联用测定方法，该法具有样品处理简单、测定周期短等优点，适用于大量样品的快速筛选、测定。
参考文献
[1] 谢东华，俞雪钧，殷居易，倪梅林.高效液相色谱-质谱联用法检测烤鳗中环丙沙星[J].理化检验-化学分册，2008（44）5：402-408.
[2] 张翠英，徐金玲，王雪芹，安华民.超高效液相色谱- 串联质谱法检测盐酸洛哌丁胺胶囊中混入诺氟沙星的研究[J].中国药房，2008（19）7：537-539.
[3] 崔相勇，张凤清，周长民，王岩松，钟启智.高效液相色谱-质谱联用法测定豆芽中恩诺沙星含量[J].食品科学，2012（33）20：180-183.
[4] 李小玲，黄向荣，万译文，陈湘艺.高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星[J].中国渔业质量与标准，2013（3）4：25-30.