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摘 要：DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式之一，在基因表达调控中发挥着重要的作用。本研究应用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术，在全基因组水平上研究不同品种甘蔗伸长期和成熟期CCGG位点的DNA甲基化水平及模式变化特征。结果表明，在伸长期，8个甘蔗品种检测到的DNA甲基化率为15.47 %～29.03 %；引物平均甲基化率为28.86 %。在成熟期5个甘蔗品种中检测到的DNA甲基化为6.98 %～14.94 %。表明DNA甲基化在甘蔗中发生频繁，且品种之间的甲基化模式存在差异，甘蔗CCGG序列中胞嘧啶甲基化内侧胞嘧啶全甲基化多于外部胞嘧啶半甲基化。
关键词：甘蔗 DNA甲基化 MSAP
广西是国内主产蔗区，蔗糖业是广西重要支柱产业。自20世纪90年代初，广西蔗糖业成为全国第一后，广西甘蔗生产占有的比重不断增加，进入21世纪以来广西蔗糖年产量占全国食糖总产量的60 %以上[1]。
DNA甲基化是一种表观遗传（epigenetic）现象。在发育过程中，虽然基因表达调控发生改变，但DNA的一级结构没有变化，它可以遗传，也可能发生逆转（脱甲基化）[2]。在高等植物中，胞嘧啶甲基化在基因表达调控中扮演了很重要的角色[3-5]。检测DNA甲基化的方法有多种，MSAP（Methylation Sensitive Amplification Polymorphism，甲基化敏感扩增多态性）技术，是在AFLP技术基础上建立起来的，之后被用于水稻基因组胞嘧啶甲基化的检测上[6]，现已广泛应用于棉花、苹果、拟南芥、香蕉、土豆、草莓等植物上，评估胞嘧啶甲基化的程度和模式[7-12]。鉴于此，研究从表观遗传学的角度出发，采用MSAP技术检测不同甘蔗品种不同时期的甲基化多态性，分析甘蔗生长过程中DNA甲基化水平、模式与变化，为进一步开展相关研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试8个甘蔗品种信息列于表1。试验材料种植于广西农业院甘蔗研究所本部试验农场。
1.2 总DNA提取与MSAP分析
选取生长正常的伸长期和成熟期单株，取其1叶用于DNA提取。DNA提取及MSAP分析参照Xiong方法实施 [13]。
1.3 数据处理
标记MSAP 扩增片段大小，以0和1建立数据库。在相同迁移率位置上，有带的记为1 ， 无带的记为0 。参照DNA分子标记数据分析方法， 将MSAP标记作为等位基因进行多态性研究， 每1条扩增条带视为1个性状。
2 结果与分析
2.1 DNA质量检测
取1μL 基因组DNA用NanoDropND-1000紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度，OD260/ OD280比值在1.8～2.0范围内，纯度较高，取出2μL纯化的基因组DNA用0.8 %琼脂糖凝胶检测结果如图1、图2所示，DNA主带清晰，降解较少，适合进行下一步分析。
图1中1～8分别为柳城05-136、桂糖03-1438、桂糖05-3626、桂糖07-645、桂糖06-1001、桂引C1-2003、桂糖06-244、桂糖06-1721。
图2中1～5分别为柳城05-136、桂糖05-3626、桂糖07-645、桂引C1-2003、桂糖06-244。
2.2 甘蔗品种甲基化分析
2.2.1 甲基化模式
根据HpaII和MspI对CCGG序列甲基化是否敏感， 可将酶切结果分4种不同类型，见表2、图3。
2.2.2 伸长期甲基化分析
使用不同引物甲基化的差异见表3。
3对引物扩增结果表明，不同引物间甲基化略有差异，引物E7 H/M5甲基化多态性条带最多，达14条，甲基化率为30.43 %；引物E5 H/M5甲基化多态性条带仅为8条，甲基化率为27.59%，在3对引物中甲基化率最低。
在甘蔗伸长期， 用3对MASP引物分析8个甘蔗品种甲基化程度，共检测到590个位点，见表4。总甲基化的位点数（包括全甲基化和仅一条链甲基化的半甲基化）分别为19、13、15、19、19、17、10和27，甲基化率分别为18.63 %、15.48 %、15.96 %、19.59 %、21.11 %、19.32 %、12.35 %和29.03 %。其中，全甲基化（双链甲基化）的条带数分别为10、8、10、14、11、8、7和18，全甲基化比率分别为9.80 %、9.52 %、10.63 %、14.43 %、12.22 %、9.09 %、8.64 %和19.35 %。半甲基化的带数分别为9、5、5、5、8、9、3和9，半甲基化率为8.82 %、5.95 %、5.31 %、5.15 %、8.89 %、10.23 %、3.70 %和9.68 %。从A、B、C 3种不同类型条带的总数来看，全甲基化高于半甲基化。由此可见，伸长期的甘蔗基因组CCGG 位点发生甲基化的方式主要是以内部胞嘧啶（Cm5CGG）双链甲基化为主。
2.2.3 成熟期甲基化分析
5个甘蔗品种成熟期甲基化水平分析表明（表5），2对引物组合（E3 H/M5，E5 H/M5）共检测到394条带，总甲基化条带数分别为13、6、13、8和10，甲基化率分别为13%、6.98 %、14.94 %、10.39 %和10.64 %。其中，全甲基化条带数分别为11、6、12、7和7，全甲基率为11 %、6.98 %、13.79 %、9.09 %和7.45 %；半甲基化的带数分别为2、0、1、1和 3，半甲基化率分别为2 %、0、1.15 %、1.30 %和3.19 %。从A、B、C 3种不同类型条带的总数来看，全甲基化高于高半甲基化高。由此可见，成熟期的甘蔗基因组CCGG 位点发生甲基化的方式主要是以内部胞嘧啶（Cm5CGG）双链甲基化为主。 3 小结与讨论
甘蔗甲基化分析表明，伸长期甲基化率为15.47 %～29.03 %；成熟期甲基化率为6.98 %～14.94 %；全甲基化率高于半甲基化。
DNA甲基化是植物基因调控机制中不可缺少的一部分，特别是对开花时间、胚乳发育等特殊组织的发育过程或发育状态进行调控。甘蔗甲基化分析表明，在伸长期甘蔗的平均甲基化水平高于水稻[13]、香蕉[10]、栗树[14]，低于拟南芥[9]和休眠期间牡丹花芽[15]。成熟期的甲基化水平明显较低。在甘蔗生长发育过程中，伸长期主要积累蔗茎产量，而成熟期则主要积累糖分。成熟期甲基化水平明显低于伸长期，可能与需要启动大量参与糖分合成、转运、积累的相关基因参与代谢有关。
从不同品种看，伸长期品种间甲基化存在明显差异，甲基化水平最高的桂糖06-1721与最低的桂糖03-1438的相差近1倍，可能主要与其自身遗传特性有关。
参考文献
[1] 贾冰. 广西蔗糖业技术创新中专利战略研究[D]. 南宁： 广西大学， 2008.
[2] Henikoff S， Matzke M A. Exploring and explaining of epigenetic effects[J]. Trends
in Genetics， 1997， 13（8）： 293-95.
[3] Meyer P， Niedenhof I， Ten L M. Evidence for cytosine methylation of non-symmetrical sequence in transgenic Petunia hybrida[J]. The EMBO Journal，1994，13（9）：2084-
2088.
[4] Ulian E C， Magill J M， Magill C W， Smith R H. DNA methylation and expression of NPTII in transgenic petunias and progeny[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1996， 92（8）： 976-981.
[5] Rossi V， Motto M， Pellegrini L. Analysis of the methylation pattern of the maize Opaque-2（O2） promoter and in vitro binding studies indicate that the O2 B-Zip protein and other endosperm factors can bind to methylated target sequences[J]. Journal of
Biological Chemistry，1997，272（21）：
13758-13765.
[6] Ashikawa I. Surveying CpG methylation at 5-1CCGG in the genomes of rice cultivars[J]. Plant Molecular Biology， 2001， 45 （1）： 31-39.
[7] Liu B， Brubaker C L， Mergeai G， Cronn R C， Wendel J F. Polyploid formation in cotton is not accompanied by rapid genomic changes[J]. Genome， 2001， 44（3）：
321-330.
[8] Hao Y J， Liu Q L， Deng X X. Effect of cryopreservation on apple genetic resources at morphological， chromosomal， and molecular levels[J]. Cryobiology， 2001， 43（1）：
46-53.
[9] Cervera M T， Ruiz-Garcia L， Martinez-Zapater J M. Analysis of DNA methylation in Arabidopsis thaliana based on methylation-sensitive AFLP markers[J]. Molecular and General Genomics， 2002， 268（4）：543-552.
[10] Echeverria S P， Valencia V H， James K A. Detection of DNA methylation changes in micropropagated banana plants using methylation-sensitive amplification polymorphism （MSAP）[J]. Plant Science， 2001， 161（2）： 359-367.
[11] Law R D， Suttle J C. Transient decreases in methylation at 5_-CCGG-3_ sequences in potato （Solanum tuberosum L.） meristem DNA during progression of tubers through dormancy precede the resumption of sprout growth[J]. Plant Molecular Biolo-
gy， 2002， 51（3）： 437-447.
[12] Hao Y J， You C， Deng X X. Analysis of ploidy and the patterns of amplified fragment length polymorphism and methylation-sensitive amplified polymorphism in strawberry plants recovered from cryopreservation[J]. Cryo- Letters， 2002， 23（1）：
37-46.
[13] Xiong L Z， Xu C G， Maroof M A， Zhang Q F. Patterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines， detected by a methylation-sensitive amplification polymorphism technique[J].Molecular and General Genetics， 1999， 261（3）： 439-446.
[14] Hasbun R， Valledor L， Berdasco M， et al. In vitro proliferation and Genome DNA methylation in adult chestuts[J]. Acta
Horticulturae，2005， 693：333-339.
[15] 盖树鹏，张风，张玉喜，郑国生. 低温解除牡丹休眠进程中基因组DNA甲基化敏感扩增多态性（MSAP）分析[J]. 农业生物技术学报，
2012，20（3）：261-267.
关键词：甘蔗 DNA甲基化 MSAP
广西是国内主产蔗区，蔗糖业是广西重要支柱产业。自20世纪90年代初，广西蔗糖业成为全国第一后，广西甘蔗生产占有的比重不断增加，进入21世纪以来广西蔗糖年产量占全国食糖总产量的60 %以上[1]。
DNA甲基化是一种表观遗传（epigenetic）现象。在发育过程中，虽然基因表达调控发生改变，但DNA的一级结构没有变化，它可以遗传，也可能发生逆转（脱甲基化）[2]。在高等植物中，胞嘧啶甲基化在基因表达调控中扮演了很重要的角色[3-5]。检测DNA甲基化的方法有多种，MSAP（Methylation Sensitive Amplification Polymorphism，甲基化敏感扩增多态性）技术，是在AFLP技术基础上建立起来的，之后被用于水稻基因组胞嘧啶甲基化的检测上[6]，现已广泛应用于棉花、苹果、拟南芥、香蕉、土豆、草莓等植物上，评估胞嘧啶甲基化的程度和模式[7-12]。鉴于此，研究从表观遗传学的角度出发，采用MSAP技术检测不同甘蔗品种不同时期的甲基化多态性，分析甘蔗生长过程中DNA甲基化水平、模式与变化，为进一步开展相关研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试8个甘蔗品种信息列于表1。试验材料种植于广西农业院甘蔗研究所本部试验农场。
1.2 总DNA提取与MSAP分析
选取生长正常的伸长期和成熟期单株，取其1叶用于DNA提取。DNA提取及MSAP分析参照Xiong方法实施 [13]。
1.3 数据处理
标记MSAP 扩增片段大小，以0和1建立数据库。在相同迁移率位置上，有带的记为1 ， 无带的记为0 。参照DNA分子标记数据分析方法， 将MSAP标记作为等位基因进行多态性研究， 每1条扩增条带视为1个性状。
2 结果与分析
2.1 DNA质量检测
取1μL 基因组DNA用NanoDropND-1000紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度，OD260/ OD280比值在1.8～2.0范围内，纯度较高，取出2μL纯化的基因组DNA用0.8 %琼脂糖凝胶检测结果如图1、图2所示，DNA主带清晰，降解较少，适合进行下一步分析。
图1中1～8分别为柳城05-136、桂糖03-1438、桂糖05-3626、桂糖07-645、桂糖06-1001、桂引C1-2003、桂糖06-244、桂糖06-1721。
图2中1～5分别为柳城05-136、桂糖05-3626、桂糖07-645、桂引C1-2003、桂糖06-244。
2.2 甘蔗品种甲基化分析
2.2.1 甲基化模式
根据HpaII和MspI对CCGG序列甲基化是否敏感， 可将酶切结果分4种不同类型，见表2、图3。
2.2.2 伸长期甲基化分析
使用不同引物甲基化的差异见表3。
3对引物扩增结果表明，不同引物间甲基化略有差异，引物E7 H/M5甲基化多态性条带最多，达14条，甲基化率为30.43 %；引物E5 H/M5甲基化多态性条带仅为8条，甲基化率为27.59%，在3对引物中甲基化率最低。
在甘蔗伸长期， 用3对MASP引物分析8个甘蔗品种甲基化程度，共检测到590个位点，见表4。总甲基化的位点数（包括全甲基化和仅一条链甲基化的半甲基化）分别为19、13、15、19、19、17、10和27，甲基化率分别为18.63 %、15.48 %、15.96 %、19.59 %、21.11 %、19.32 %、12.35 %和29.03 %。其中，全甲基化（双链甲基化）的条带数分别为10、8、10、14、11、8、7和18，全甲基化比率分别为9.80 %、9.52 %、10.63 %、14.43 %、12.22 %、9.09 %、8.64 %和19.35 %。半甲基化的带数分别为9、5、5、5、8、9、3和9，半甲基化率为8.82 %、5.95 %、5.31 %、5.15 %、8.89 %、10.23 %、3.70 %和9.68 %。从A、B、C 3种不同类型条带的总数来看，全甲基化高于半甲基化。由此可见，伸长期的甘蔗基因组CCGG 位点发生甲基化的方式主要是以内部胞嘧啶（Cm5CGG）双链甲基化为主。
2.2.3 成熟期甲基化分析
5个甘蔗品种成熟期甲基化水平分析表明（表5），2对引物组合（E3 H/M5，E5 H/M5）共检测到394条带，总甲基化条带数分别为13、6、13、8和10，甲基化率分别为13%、6.98 %、14.94 %、10.39 %和10.64 %。其中，全甲基化条带数分别为11、6、12、7和7，全甲基率为11 %、6.98 %、13.79 %、9.09 %和7.45 %；半甲基化的带数分别为2、0、1、1和 3，半甲基化率分别为2 %、0、1.15 %、1.30 %和3.19 %。从A、B、C 3种不同类型条带的总数来看，全甲基化高于高半甲基化高。由此可见，成熟期的甘蔗基因组CCGG 位点发生甲基化的方式主要是以内部胞嘧啶（Cm5CGG）双链甲基化为主。 3 小结与讨论
甘蔗甲基化分析表明，伸长期甲基化率为15.47 %～29.03 %；成熟期甲基化率为6.98 %～14.94 %；全甲基化率高于半甲基化。
DNA甲基化是植物基因调控机制中不可缺少的一部分，特别是对开花时间、胚乳发育等特殊组织的发育过程或发育状态进行调控。甘蔗甲基化分析表明，在伸长期甘蔗的平均甲基化水平高于水稻[13]、香蕉[10]、栗树[14]，低于拟南芥[9]和休眠期间牡丹花芽[15]。成熟期的甲基化水平明显较低。在甘蔗生长发育过程中，伸长期主要积累蔗茎产量，而成熟期则主要积累糖分。成熟期甲基化水平明显低于伸长期，可能与需要启动大量参与糖分合成、转运、积累的相关基因参与代谢有关。
从不同品种看，伸长期品种间甲基化存在明显差异，甲基化水平最高的桂糖06-1721与最低的桂糖03-1438的相差近1倍，可能主要与其自身遗传特性有关。
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[12] Hao Y J， You C， Deng X X. Analysis of ploidy and the patterns of amplified fragment length polymorphism and methylation-sensitive amplified polymorphism in strawberry plants recovered from cryopreservation[J]. Cryo- Letters， 2002， 23（1）：
37-46.
[13] Xiong L Z， Xu C G， Maroof M A， Zhang Q F. Patterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines， detected by a methylation-sensitive amplification polymorphism technique[J].Molecular and General Genetics， 1999， 261（3）： 439-446.
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