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[摘要] 目的 观察连接黏附分子A（junctional adhesion molecule A，JAM-A）在人甲状腺乳头状癌和正常甲状腺组织中的表达情况，初步探讨其表达与临床病理特征之间的关系，进一步观察其表达与淋巴转移的关系。 方法 通过免疫组织化学染色法检测120例甲状腺乳头状癌组织和60例正常甲状腺组织中JAM-A蛋白的表达情况。结果 JAM-A在正常甲状腺组织、不伴有淋巴结转移的原发甲状腺癌组织、伴随有淋巴结转移的原发甲状腺癌组织中的阳性表达率逐渐降低。JAM-A在甲状腺乳头状癌组织和正常甲状腺组织间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；JAM-A在伴随有淋巴结转移的原发甲状腺癌组织和不伴有淋巴结转移的原发甲状腺乳头状癌组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 JAM-A的表达与甲状腺乳头状癌恶性程度密切相关，随着出现淋巴结的转移，其表达逐渐降低，与其呈负相关，因此JAM-A在甲状腺乳头状癌的治疗决策、预后评估中具有重要的应用价值。
[关键词] 甲状腺乳头状癌；连接黏附分子A；转移；预后
[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）31-0005-05
目前甲状腺乳头状癌并颈部淋巴结转移是决定外科医生甲状腺癌手术方式的重要因素之一。而近来不同种细胞黏附分子在不同恶性肿瘤浸润、侵袭和转移中所扮演的角色不同，连接黏附分子（junction adhesion molecule，JAM）在细胞间的连接有极其重要的意义，国外研究表明JAM在体内外保持细胞内环境稳态、新生血管生成、肿瘤侵袭、远处转移及周边浸润等众多病理生理过程中均扮演着极其重要的角色[1]。然而目前JAM在原发性甲状腺乳头状癌中的表达及其重要临床预后意义仍未被阐述清楚，JAM表达是否与淋巴结转移或远处转移有关系仍然未知。本文主要目的是通过免疫组化检测法进一步阐明连接黏附分子A（junctional adhesion molecule A，JAM-A）在原发性甲状腺乳头状癌中的蛋白表达情况，并且进一步分析JAM-A表达与甲状腺乳头状癌是否伴有淋巴转移之间的联系。现报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料
通过回顾性收集绍兴市中心医院（中国医科大学绍兴医院）病理科2010年1月～2015年12月期间诊断的甲状腺病变组织180例，均为病理科存档标本，180例样本中包括120例甲状腺乳头状癌和60例正常甲状腺组织。本研究经过绍兴市中心医院伦理委员会集体讨论通过，获得患者的知情同意并且签署知情同意书。60例正常甲状腺组织的患者中，男30例，女30例，年龄<45岁30例，年龄≥45岁30例，JAM-A在不同年龄组与性别组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。120例甲状腺乳头状癌中，女92例，男28例；年龄18～76岁，中位年龄48岁；肿瘤直径0.1～5.0 cm，其中瘤体直径<3.0 cm者96例，瘤體直径≥3.0 cm者24例；24例肿瘤合并包膜浸润；40例同时伴有颈部或中央区淋巴结转移，另外80例乳头状癌患者无淋巴结转移；按照肿瘤国际临床疾病分期进行重新分类，肿瘤的TNM分期按照AJCC提出的标准进行确定。患者处于TNMⅠ期54例，TNMⅡ期26例，TNM Ⅲ期40例，JAM-A在不同年龄组、性别、肿瘤直径、是否包膜侵犯、癌灶数量、与临床分期比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 实验方法
采用免疫组织化学SP染色方法，进行染色标记JAM-A抗体。具体操作过程如下：（1）标本均经过石蜡切片、脱蜡和水化三重HE标本制作全部标准流程后，利用新配置的蒸馏水冲洗3次已经制备好的切片，每次冲洗玻片3 min；（2）使用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，室温下孵育8 min或水浴箱孵育3 min左右；（3）接着以上步骤用新配置的蒸馏水冲洗2次，每次大约5 min，然后放置在高温压力锅中进行组织抗原的修复，用新配置的PBS液体（pH 7.4）冲洗3遍，每次冲洗3 min；（4）在室温下在玻片上小心滴加4%羊血清封闭 30 min，尽量减少组织的非特异性染色；（5）载玻片上滴加一抗，室温孵育60 min；（6）然后用新配置的PBS缓冲液体冲洗3次，每次冲洗4 min，利用滴加二步的方法MaxvisionTM/HPR孵育15 min；（7）利用PBS缓冲液体冲洗载玻片3次，平均每次5 min。（8）轻轻甩去PBS液体，滴加新鲜配制的DAB显色液2～5 min左右，最后在光学显微镜下观察染色情况，抗体的阳性信号为棕黄色或棕褐色颗粒着色，着色定位在细胞胞质中。染色显色的时间为3 min左右，然后终止该反应，用自来水充分冲洗切片。进行苏木素复染后，用0.1%盐酸酒精分化，然后自来水冲洗5 min左右。通过不同梯度的酒精进行脱水，二甲苯液体进行透明，最后利用中性树胶进行封片。高年资病理医师阅片并判读确定染色的最终结果，然后讨论并分析JAM-A在不同组种的表达情况及其不同组间的相互关系。
1.3结果判定与分析
免疫组织化学染色标记的结果最后由本单位2位副主任医师和外单位病理科2位主任医师分别进行双盲阅片，按照给定的评分标准评分，最终统计4位医师的结果均一致者作为最后的统计结果。免疫组织化学评分标准主要有两种，分别按照阳性强度评分和阳性细胞占所有细胞的比例进行评分。JAM-A蛋白免疫组化染色定位在细胞胞质中着色，免疫组化结果判定按照Sun W等[3]文献中给出的评分方法：（1）根据细胞的染色强度评分：病变区域细胞无染色为 0分；呈淡黄色颗粒染色、明显高于切片组织背景着色评分为 1分；病变组织呈浅棕黄色颗粒时将其结果评分为2分；病变组织中存在大量深棕黄色颗粒时将其免疫组化结果评分为3分；（2）按照阳性细胞数的计数评分：将每张制作的切片不同观察者间随机观察至少10个左右的高倍视野（10个/HPF），计数染色细胞数的阳性百分比例，1%～24%评分为1分；25%～49%评分为2分；50%～75%评分为3分；>75%评分为4分。（3）结合以上两个步骤后，将染色强度评分与阳性细胞数比例的评分取其之和，如果总评分相加评分<2分为阴性（-），评分2～3分为弱阳性（ ），最终评分结果4～5分者为中度阳性（ ），最终评分结果6～7分者为强阳性（ ）。
[关键词] 甲状腺乳头状癌；连接黏附分子A；转移；预后
[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）31-0005-05
目前甲状腺乳头状癌并颈部淋巴结转移是决定外科医生甲状腺癌手术方式的重要因素之一。而近来不同种细胞黏附分子在不同恶性肿瘤浸润、侵袭和转移中所扮演的角色不同，连接黏附分子（junction adhesion molecule，JAM）在细胞间的连接有极其重要的意义，国外研究表明JAM在体内外保持细胞内环境稳态、新生血管生成、肿瘤侵袭、远处转移及周边浸润等众多病理生理过程中均扮演着极其重要的角色[1]。然而目前JAM在原发性甲状腺乳头状癌中的表达及其重要临床预后意义仍未被阐述清楚，JAM表达是否与淋巴结转移或远处转移有关系仍然未知。本文主要目的是通过免疫组化检测法进一步阐明连接黏附分子A（junctional adhesion molecule A，JAM-A）在原发性甲状腺乳头状癌中的蛋白表达情况，并且进一步分析JAM-A表达与甲状腺乳头状癌是否伴有淋巴转移之间的联系。现报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料
通过回顾性收集绍兴市中心医院（中国医科大学绍兴医院）病理科2010年1月～2015年12月期间诊断的甲状腺病变组织180例，均为病理科存档标本，180例样本中包括120例甲状腺乳头状癌和60例正常甲状腺组织。本研究经过绍兴市中心医院伦理委员会集体讨论通过，获得患者的知情同意并且签署知情同意书。60例正常甲状腺组织的患者中，男30例，女30例，年龄<45岁30例，年龄≥45岁30例，JAM-A在不同年龄组与性别组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。120例甲状腺乳头状癌中，女92例，男28例；年龄18～76岁，中位年龄48岁；肿瘤直径0.1～5.0 cm，其中瘤体直径<3.0 cm者96例，瘤體直径≥3.0 cm者24例；24例肿瘤合并包膜浸润；40例同时伴有颈部或中央区淋巴结转移，另外80例乳头状癌患者无淋巴结转移；按照肿瘤国际临床疾病分期进行重新分类，肿瘤的TNM分期按照AJCC提出的标准进行确定。患者处于TNMⅠ期54例，TNMⅡ期26例，TNM Ⅲ期40例，JAM-A在不同年龄组、性别、肿瘤直径、是否包膜侵犯、癌灶数量、与临床分期比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 实验方法
采用免疫组织化学SP染色方法，进行染色标记JAM-A抗体。具体操作过程如下：（1）标本均经过石蜡切片、脱蜡和水化三重HE标本制作全部标准流程后，利用新配置的蒸馏水冲洗3次已经制备好的切片，每次冲洗玻片3 min；（2）使用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，室温下孵育8 min或水浴箱孵育3 min左右；（3）接着以上步骤用新配置的蒸馏水冲洗2次，每次大约5 min，然后放置在高温压力锅中进行组织抗原的修复，用新配置的PBS液体（pH 7.4）冲洗3遍，每次冲洗3 min；（4）在室温下在玻片上小心滴加4%羊血清封闭 30 min，尽量减少组织的非特异性染色；（5）载玻片上滴加一抗，室温孵育60 min；（6）然后用新配置的PBS缓冲液体冲洗3次，每次冲洗4 min，利用滴加二步的方法MaxvisionTM/HPR孵育15 min；（7）利用PBS缓冲液体冲洗载玻片3次，平均每次5 min。（8）轻轻甩去PBS液体，滴加新鲜配制的DAB显色液2～5 min左右，最后在光学显微镜下观察染色情况，抗体的阳性信号为棕黄色或棕褐色颗粒着色，着色定位在细胞胞质中。染色显色的时间为3 min左右，然后终止该反应，用自来水充分冲洗切片。进行苏木素复染后，用0.1%盐酸酒精分化，然后自来水冲洗5 min左右。通过不同梯度的酒精进行脱水，二甲苯液体进行透明，最后利用中性树胶进行封片。高年资病理医师阅片并判读确定染色的最终结果，然后讨论并分析JAM-A在不同组种的表达情况及其不同组间的相互关系。
1.3结果判定与分析
免疫组织化学染色标记的结果最后由本单位2位副主任医师和外单位病理科2位主任医师分别进行双盲阅片，按照给定的评分标准评分，最终统计4位医师的结果均一致者作为最后的统计结果。免疫组织化学评分标准主要有两种，分别按照阳性强度评分和阳性细胞占所有细胞的比例进行评分。JAM-A蛋白免疫组化染色定位在细胞胞质中着色，免疫组化结果判定按照Sun W等[3]文献中给出的评分方法：（1）根据细胞的染色强度评分：病变区域细胞无染色为 0分；呈淡黄色颗粒染色、明显高于切片组织背景着色评分为 1分；病变组织呈浅棕黄色颗粒时将其结果评分为2分；病变组织中存在大量深棕黄色颗粒时将其免疫组化结果评分为3分；（2）按照阳性细胞数的计数评分：将每张制作的切片不同观察者间随机观察至少10个左右的高倍视野（10个/HPF），计数染色细胞数的阳性百分比例，1%～24%评分为1分；25%～49%评分为2分；50%～75%评分为3分；>75%评分为4分。（3）结合以上两个步骤后，将染色强度评分与阳性细胞数比例的评分取其之和，如果总评分相加评分<2分为阴性（-），评分2～3分为弱阳性（ ），最终评分结果4～5分者为中度阳性（ ），最终评分结果6～7分者为强阳性（ ）。