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探究启动子结合蛋白(C/EBPα)对于间充质干细胞(MSC)C3H10T1/2细胞成骨调节的分子机制。
方法体外构建成骨分化模型,应用反向聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹检测C3H10T1/2细胞成骨分化时过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的mRNA和蛋白质的表达;通过构建干扰PPARγ siRNA的腺病毒载体及PPARγ拮抗剂G3335,观察PPARγ对于激活C/EBPα表达的作用。色质免疫沉淀分析(ChIP)检测PPARγ2位于C/EBPα启动子-1 286 bp/-1 065 bp区域内的结合位点并检测PPARγ与C/EBPα启动子-1 286 bp/-1 065 bp区段DNA甲基化和组蛋白高度去乙酰化的关系。
结果C3H10T1/2细胞在成骨分化时,PPARγ的mRNA和蛋白质的表达呈先升高后下降的双时相反应。siRNA和G3335引起的PPARγ活性的下调抑制了C/EBPα在C3H10T1/2细胞成骨分化时的上调(对照组6.1 mg/L,罗格列酮组13.0 mg/L,罗格列酮+G3335组11.0 mg/L, P<0.05)。DNA甲基化能减弱PPARγ2向-1 286 bp/-1 065 bp区段的结合能力。
结论C3H10T1/2细胞在成骨分化时,PPARγ通过结合至C/EBPα启动子-1 286 bp/-1 065 bp区段来促进该基因的表达,阻抑了PPARγ与之结合,与PPARγ相关的蛋白去乙酰化酶抑制得以解除,从而下调了-1 286 bp/-1 065 bp区段的组蛋白乙酰化,C/EBPα启动子促进C3H10T1/2细胞成骨过程。