【摘 要】
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目的:构建p53双荧光报告载体,验证其能否模拟野生型p53的生物学活性并适用于高通量筛选。方法:用PCR在p53和萤火虫荧光素酶的开放阅读框两端引入酶切位点并移除p53的终止密码
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目的:构建p53双荧光报告载体,验证其能否模拟野生型p53的生物学活性并适用于高通量筛选。方法:用PCR在p53和萤火虫荧光素酶的开放阅读框两端引入酶切位点并移除p53的终止密码和萤火虫荧光素酶的起始密码,然后将二者插入到由内部核糖体进入位点引导的海肾荧光素酶的上游,从而构建出一个能表达P53萤火虫荧光素融合蛋白的p53FL/IRES/RL双荧光报告载体。转染该报告载体后,检测被表达的P53荧光素融合蛋白是否被MDM2降解、该融合蛋白的亚细胞定位和它对p53特异性启动子的诱导。结果:成功构建出p53双荧光报告载体。该载体在宿主细胞内表达的P53荧光素融合蛋白能被MDM2降解;主要分布于细胞核;具有野生型p53的转录活性。结论:新构建的p53双荧光报告载体p53FL/IRES/RL能有效模拟野生型p53的功能,适用于高通量筛选调节P53蛋白含量的药物、基因或化合物。
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