【摘 要】
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目的构建hsa-miR-424基因慢病毒表达载体,并鉴定miR-424在细胞内表达水平,研究hsa-miR-424对宫颈癌Hela细胞增殖的影响。方法以人基因组DNA为模板,设计合成miR-424的上下游引
【机 构】
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第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心
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目的构建hsa-miR-424基因慢病毒表达载体,并鉴定miR-424在细胞内表达水平,研究hsa-miR-424对宫颈癌Hela细胞增殖的影响。方法以人基因组DNA为模板,设计合成miR-424的上下游引物,PCR扩增目的片段,回收产物将其连入pMD18T载体中,进行测序。再以pMD18T-miR424为模板进行PCR扩增,将其中表达pMD18T-miR424的结构经酶切后插入pLentis-CMV-GFP-MCS-PGK-PURO载体,构建成pLentis-CMV-GFP-miR424-PGK-PURO,在293T细胞中与pSPAX2、pMD2.G包装产生所需的慢病毒,再用含慢病毒的上清液感染Hela细胞。结果 miR-424基因与慢病毒载体连接成功,测序结果证明了插入到质粒载体中的miR-424前体序列完全正确,成功构建pLentis-CMV-GFP-miR424重组慢病毒载体,用其感染宫颈癌Hela细胞后上调miR-424的表达近60倍。采用MTT法检测增殖结果提示:感染miR-424慢病毒的宫颈癌Hela细胞株均存在细胞增殖减慢。结论成功的构建了miR-424慢病毒载体,建立了高效稳定表达miR-424的细胞株,并用含慢病毒的上清液感染宫颈癌Hela细胞,成功抑制了Hela细胞的增殖,为后续相关的研究奠定了良好的基础。
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