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摘 要：为提高紫苏利用率，探究紫苏花青素最佳提取条件并对其抗癌活性进行研究.以新鲜紫苏叶为试验材料，采用超声波辅助提取法，研究在不同提取温度、提取时间、溶剂浓度和溶液酸碱度条件下对原花青素提取效果的影响，并用噻唑蓝法测定提取的花青素对肿瘤细胞（A549）的抗增殖活性.结果表明，当提取温度为60℃、时间为90min、溶剂浓度为70%以及pH为8时，原花青素提取的效果最好;原花青素浓度为100μg/mL时，对A549细胞的抗增值性较好，IC50值为28.67μg/mL.
关键词：紫苏;原花青素;A549细胞;抗增殖活性
中图分类号：Q946 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2019）12-0028-03
0 引言
由于人们对饮食健康的重视，天然色素的需求日益增多，且其对癌症、眼疾、心血管疾病等具有较好的预防效果[1]，因此开发、研究和利用天然食用色素成为研究热点.紫苏属唇形科，是一年生草本植物，新鲜紫苏叶片中，花色素苷类色素含量大，具有较好的开发前景.花色素苷是一种类黄酮类天然色素，不仅具有较强的抗氧化作用，还具有自由基清除活性[2].花色苷类物质在抗消炎作用、关节炎、预防心脑血管疾病、神经细胞衰老、癌症、糖尿病等起着重要作用[3].恶性肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病，其发病率和死亡率仅次于心脑血管疾病，位列第二[4].近年来癌症的治疗，常采用手术、化疗等措施，其中化疗在综合治疗领域有着重要地位，但在临床应用时化疗仍存在疗效、副作用以及肿瘤细胞耐药等方面问题.原花青素可预防细胞突变、癌细胞生成，控制肿瘤生长快慢，减小肿瘤体积[5，6].以紫苏叶为材料，探究其原花青素最佳提取工艺，并进行抗癌活性試验，为色素在抗癌方面的研究提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜紫苏叶（宿州科学院提供）;A549细胞株（购于上海细胞生物学研究所）;甲醇、盐酸、醋酸铅、乙酸（均购于上海国药集团）.
1.2 主要仪器
扫描酶标仪（Sunrise，奥地利TECAN）;CO2培养箱（Heracel，美国Kendro）;倒置荧光显微镜（OLYMPUS CX-40，日本OLYMPUS）等.
1.3 试验方法
工艺流程：紫苏叶→烘干→粉碎→过筛→提取→浓缩→测定
1.3.1 原料预处理
将紫苏叶用水洗净，沥干，置于干燥箱烘干至恒重（35-40℃），将烘干的紫苏叶用粉碎机粉碎，过50目筛，待用.
1.3.2 紫苏原花青素含量测定
称取原花青素标准品5.0mg，用调节pH后的去离子水定容到50mL，分别配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL标准品溶液浓度系列.以纯净水为参比液进行紫外检测，原花青素标准溶液在765nm处有最大吸光度.根据标准品溶液的吸光度与浓度之间的关系，将所得的数据经过回归处理后，绘制出紫苏原花青素标准品的标准曲线y=2.2367x+0.0688.R2=0.9986.
1.3.3 单因素试验
称取备用的紫苏叶粉末2.0g于容量瓶中，提取剂用60%、70%、80%的pH为4、6、8的甲醇，在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃五个不同温度下超声提取70min、80min、90min，提取液经过2000r/min离心10min过滤后吸取0.5mL，再用调节pH后的纯净水定容至50mL容量瓶中，在最大波长765nm下测得吸光度ΔA的值，根据吸光度ΔA的值，利用回归方程解出浓度，再计算出提取液中原花青素含量.
1.3.4 正交试验
根据单因素试验结果，得出较优水平，根据四因素三水平正交表[7]进行正交试验，以提取液原花青素浓度为指标，探究最佳提取工艺.
1.3.5 原花青素抗肿瘤细胞的增殖实验
收集对数期A549细胞，吹悬浮混匀并稀释至每孔细胞数约5×103个，铺于96孔细胞培养板上，每孔100μL细胞悬液.孔板外围边缘用PBS液体等体积填充.细胞贴壁后加入配置好的紫苏花青素溶液，4个浓度，3个重复.每孔100μL.24h后，每孔加20μL MTT溶液，继续培养4h.用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定光吸收值，根据寇氏公式，计算IC50值[8].
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 提取温度对原花青素提取效果的影响
温度越高，细胞膜的通透性越高，会加速对细胞的破坏，从而使得细胞内溶物相比较容易提取，但温度过高，原花青素含量降低，因为高温易使原花青素分解.如图1所示，提取液原花青素含量随温度升高而增加，60℃时达到峰值;超过60℃，原花青素含量呈下降趋势，说明原花青素具有热不稳定性，最佳提取温度为60℃.
2.1.2 提取时间对原花青素提取效果的影响
由图2可知，90min前原花青素含量随提取时间增加呈上升趋势，当时间达到90min时原花青素含量达到最大，随后开始下降.提取时间过长原花青素的稳定性降低，导致原花青素容易分解;提取时间过长还会导致原花青素含量的损失，因为紫苏中含有多酚氧化酶，而多酚氧化酶能够破坏紫苏原花青素.但提取时间过短则导致提取不充分，因此最佳提取时间为90min.
2.1.3 甲醇浓度对原花青素提取效果的影响
随着甲醇浓度逐渐升高，提取液原花青素含量上升，甲醇浓度为70%时达到最高.因为紫苏中还含有很多的糖和其他水溶性色素等，低浓度甲醇提取时糖和水溶性色素的溶解性较好，而这些物质会影响原花青素的溶出，高浓度甲醇提取时，原花青素提取效果较好，因为极性较强的糖和水溶性色素等此时溶出较少.由图3可知，最佳甲醇浓度为70%. 2.1.4 pH对原花青素提取效果的影响
由图4可知，当pH为6时，紫苏原花青素的含量最高，稳定性最好，当pH<6.0时，原花青素的含量是随着pH上升而上升，当pH>6.0时，原花青素含量随pH上升而减少的，故最佳提取溶剂pH为6.
2.2 正交试验结果
由表1可知，在单因素的基础上进行正交试验，由K值数据可以得出，最优提取条件是60℃下用pH为8的70%的甲醇提取90min.
2.3 原花青素抗癌活性
由表2可得，当原花青素浓度为100μg/mL时对A549细胞的抑制作用最好.
3 结论与讨论
提取温度、提取时间、甲醇浓度、pH值均会影响紫苏原花青素的提取效果，通过单因素和正交试验得到最优条件为：提取温度为60℃、提取时间为80min、甲醇浓度为70%、pH值为8，经验证此时提取液原花青素含量为5.36mg/mL.紫苏原花青素对A549癌细胞的抑制性较强，且随花青素浓度的增大，對癌细胞的抑制性增强，与蓝莓花青素呈现剂量依赖性诱导癌细胞凋亡[9]结论一致，也与葡萄籽原花青素在抗癌作用上相同[10].紫苏原花青素既不影响机体正常细胞又对A549癌细胞具有极强的细胞抑制性，提示其具有较好的抗癌活性，对其在抗癌药物的应用提供理论依据.
参考文献：
〔1〕李红侠，方雪梅，徐礼生，等.蓝莓冻果花色素苷的提取及抗癌活性的研究[J].中国食品添加剂，2017（2）：87-92.
〔2〕段文凯，尹涛，解玲琴.草莓花青素的微波提取工艺研究[J].现代食品，2019：79-84.
〔3〕谭利利，徐俊英，龚珂，等.花色素的抗癌研究进展[J]，吉林医药学院学报，2014，35（2）：128-132.
〔4〕JemalA， Bray F， Center MM， etal. Global cancer statistics. CA-Cancer J Clin 2011;61：69-90.
〔5〕王二雷.蓝莓花青素高纯提取物的制备技术及诱导肿瘤细胞凋亡作用研究[D].吉林大学，2014，35（4）：35-96.
〔6〕张勇，周丽明，张超，等.苹果原花色素提取分离及其抗氧化作用[J].上饶师范学院学报，2018，38（6）：56-60.
〔7〕刘娟，齐永亮.正交试验法优选铃兰总黄酮的提取工艺[J].佳木斯大学学报（自然科学版），2007， 25（4）：563.
〔8〕Mohammad Fattahi， Vahideh Nazeri， Laura Torras-Claveria， etal. A new biotechnological source of rosmarinic acid and surface flavonoids： Hairy root cultures of Dracocephalum kotschyi Boiss[J] . Industrial Crops & Products. 2013， 119（4）：65-68.
〔9〕侯锐，王利，李少伟，等.蓝莓花青素诱导结肠癌LS174T细胞凋亡和抑制其增殖[J].基础医学与临床，2016，36（11）：68-72.
〔10〕王华，刘霞，杨继红.等.华葡萄籽原花青素抗癌活性及其机制研究进展[J].安徽大学学报（自然科学版），2012，36（4）：101-108.
关键词：紫苏;原花青素;A549细胞;抗增殖活性
中图分类号：Q946 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2019）12-0028-03
0 引言
由于人们对饮食健康的重视，天然色素的需求日益增多，且其对癌症、眼疾、心血管疾病等具有较好的预防效果[1]，因此开发、研究和利用天然食用色素成为研究热点.紫苏属唇形科，是一年生草本植物，新鲜紫苏叶片中，花色素苷类色素含量大，具有较好的开发前景.花色素苷是一种类黄酮类天然色素，不仅具有较强的抗氧化作用，还具有自由基清除活性[2].花色苷类物质在抗消炎作用、关节炎、预防心脑血管疾病、神经细胞衰老、癌症、糖尿病等起着重要作用[3].恶性肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病，其发病率和死亡率仅次于心脑血管疾病，位列第二[4].近年来癌症的治疗，常采用手术、化疗等措施，其中化疗在综合治疗领域有着重要地位，但在临床应用时化疗仍存在疗效、副作用以及肿瘤细胞耐药等方面问题.原花青素可预防细胞突变、癌细胞生成，控制肿瘤生长快慢，减小肿瘤体积[5，6].以紫苏叶为材料，探究其原花青素最佳提取工艺，并进行抗癌活性試验，为色素在抗癌方面的研究提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜紫苏叶（宿州科学院提供）;A549细胞株（购于上海细胞生物学研究所）;甲醇、盐酸、醋酸铅、乙酸（均购于上海国药集团）.
1.2 主要仪器
扫描酶标仪（Sunrise，奥地利TECAN）;CO2培养箱（Heracel，美国Kendro）;倒置荧光显微镜（OLYMPUS CX-40，日本OLYMPUS）等.
1.3 试验方法
工艺流程：紫苏叶→烘干→粉碎→过筛→提取→浓缩→测定
1.3.1 原料预处理
将紫苏叶用水洗净，沥干，置于干燥箱烘干至恒重（35-40℃），将烘干的紫苏叶用粉碎机粉碎，过50目筛，待用.
1.3.2 紫苏原花青素含量测定
称取原花青素标准品5.0mg，用调节pH后的去离子水定容到50mL，分别配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL标准品溶液浓度系列.以纯净水为参比液进行紫外检测，原花青素标准溶液在765nm处有最大吸光度.根据标准品溶液的吸光度与浓度之间的关系，将所得的数据经过回归处理后，绘制出紫苏原花青素标准品的标准曲线y=2.2367x+0.0688.R2=0.9986.
1.3.3 单因素试验
称取备用的紫苏叶粉末2.0g于容量瓶中，提取剂用60%、70%、80%的pH为4、6、8的甲醇，在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃五个不同温度下超声提取70min、80min、90min，提取液经过2000r/min离心10min过滤后吸取0.5mL，再用调节pH后的纯净水定容至50mL容量瓶中，在最大波长765nm下测得吸光度ΔA的值，根据吸光度ΔA的值，利用回归方程解出浓度，再计算出提取液中原花青素含量.
1.3.4 正交试验
根据单因素试验结果，得出较优水平，根据四因素三水平正交表[7]进行正交试验，以提取液原花青素浓度为指标，探究最佳提取工艺.
1.3.5 原花青素抗肿瘤细胞的增殖实验
收集对数期A549细胞，吹悬浮混匀并稀释至每孔细胞数约5×103个，铺于96孔细胞培养板上，每孔100μL细胞悬液.孔板外围边缘用PBS液体等体积填充.细胞贴壁后加入配置好的紫苏花青素溶液，4个浓度，3个重复.每孔100μL.24h后，每孔加20μL MTT溶液，继续培养4h.用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定光吸收值，根据寇氏公式，计算IC50值[8].
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 提取温度对原花青素提取效果的影响
温度越高，细胞膜的通透性越高，会加速对细胞的破坏，从而使得细胞内溶物相比较容易提取，但温度过高，原花青素含量降低，因为高温易使原花青素分解.如图1所示，提取液原花青素含量随温度升高而增加，60℃时达到峰值;超过60℃，原花青素含量呈下降趋势，说明原花青素具有热不稳定性，最佳提取温度为60℃.
2.1.2 提取时间对原花青素提取效果的影响
由图2可知，90min前原花青素含量随提取时间增加呈上升趋势，当时间达到90min时原花青素含量达到最大，随后开始下降.提取时间过长原花青素的稳定性降低，导致原花青素容易分解;提取时间过长还会导致原花青素含量的损失，因为紫苏中含有多酚氧化酶，而多酚氧化酶能够破坏紫苏原花青素.但提取时间过短则导致提取不充分，因此最佳提取时间为90min.
2.1.3 甲醇浓度对原花青素提取效果的影响
随着甲醇浓度逐渐升高，提取液原花青素含量上升，甲醇浓度为70%时达到最高.因为紫苏中还含有很多的糖和其他水溶性色素等，低浓度甲醇提取时糖和水溶性色素的溶解性较好，而这些物质会影响原花青素的溶出，高浓度甲醇提取时，原花青素提取效果较好，因为极性较强的糖和水溶性色素等此时溶出较少.由图3可知，最佳甲醇浓度为70%. 2.1.4 pH对原花青素提取效果的影响
由图4可知，当pH为6时，紫苏原花青素的含量最高，稳定性最好，当pH<6.0时，原花青素的含量是随着pH上升而上升，当pH>6.0时，原花青素含量随pH上升而减少的，故最佳提取溶剂pH为6.
2.2 正交试验结果
由表1可知，在单因素的基础上进行正交试验，由K值数据可以得出，最优提取条件是60℃下用pH为8的70%的甲醇提取90min.
2.3 原花青素抗癌活性
由表2可得，当原花青素浓度为100μg/mL时对A549细胞的抑制作用最好.
3 结论与讨论
提取温度、提取时间、甲醇浓度、pH值均会影响紫苏原花青素的提取效果，通过单因素和正交试验得到最优条件为：提取温度为60℃、提取时间为80min、甲醇浓度为70%、pH值为8，经验证此时提取液原花青素含量为5.36mg/mL.紫苏原花青素对A549癌细胞的抑制性较强，且随花青素浓度的增大，對癌细胞的抑制性增强，与蓝莓花青素呈现剂量依赖性诱导癌细胞凋亡[9]结论一致，也与葡萄籽原花青素在抗癌作用上相同[10].紫苏原花青素既不影响机体正常细胞又对A549癌细胞具有极强的细胞抑制性，提示其具有较好的抗癌活性，对其在抗癌药物的应用提供理论依据.
参考文献：
〔1〕李红侠，方雪梅，徐礼生，等.蓝莓冻果花色素苷的提取及抗癌活性的研究[J].中国食品添加剂，2017（2）：87-92.
〔2〕段文凯，尹涛，解玲琴.草莓花青素的微波提取工艺研究[J].现代食品，2019：79-84.
〔3〕谭利利，徐俊英，龚珂，等.花色素的抗癌研究进展[J]，吉林医药学院学报，2014，35（2）：128-132.
〔4〕JemalA， Bray F， Center MM， etal. Global cancer statistics. CA-Cancer J Clin 2011;61：69-90.
〔5〕王二雷.蓝莓花青素高纯提取物的制备技术及诱导肿瘤细胞凋亡作用研究[D].吉林大学，2014，35（4）：35-96.
〔6〕张勇，周丽明，张超，等.苹果原花色素提取分离及其抗氧化作用[J].上饶师范学院学报，2018，38（6）：56-60.
〔7〕刘娟，齐永亮.正交试验法优选铃兰总黄酮的提取工艺[J].佳木斯大学学报（自然科学版），2007， 25（4）：563.
〔8〕Mohammad Fattahi， Vahideh Nazeri， Laura Torras-Claveria， etal. A new biotechnological source of rosmarinic acid and surface flavonoids： Hairy root cultures of Dracocephalum kotschyi Boiss[J] . Industrial Crops & Products. 2013， 119（4）：65-68.
〔9〕侯锐，王利，李少伟，等.蓝莓花青素诱导结肠癌LS174T细胞凋亡和抑制其增殖[J].基础医学与临床，2016，36（11）：68-72.
〔10〕王华，刘霞，杨继红.等.华葡萄籽原花青素抗癌活性及其机制研究进展[J].安徽大学学报（自然科学版），2012，36（4）：101-108.