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摘要
[目的]研究无患子总皂苷体外对酪氨酸酶的抑制率。[方法]超声波提取法，溶剂用水、30%乙醇和60%乙醇对无患子总皂苷提取，用大孔树脂（D101）富集水、30%乙醇和70%乙醇部分，紫外分光光度計法，测量酪氨酸酶抑制率。[结果]超声波提取得率中，水提得率（18.56%）最高，60%乙醇提取得率为14.46%，而30%乙醇提取得率为17.85%，接近水提取得率；大孔树脂富集后70%乙醇洗脱部分抑制率高于30%乙醇部分和水部分；与熊果酸比较，70%乙醇洗脱部分、30%乙醇洗脱部分和总皂苷对酪氨酸酶均具有明显的抑制作用。[结论]无患子总皂苷及30%乙醇和70%乙醇大孔树脂洗脱部位对酪氨酸酶抑制率较高，可以作为优良的美白护肤品天然添加剂，应用于生产中。
关键词 无患子；总皂苷；酪氨酸酶；体外；抑制率
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-056-03
基金项目 吉林农业科技学院大学生科技创新科研项目（2014052）。
作者简介
陈雷（1989-），男，吉林松原人，本科生，专业：中药资源与开发。*通讯作者，讲师，硕士，从事中药新药开发研究。
收稿日期20150526
无患子（Sapindus mukurossi Gaertn.）本草纲目中称为木患子，我国产于长江流域以南。无患子具有很强药用价值，其果皮、种子、种仁、根、皮、叶均可以用作医药原材料[1]， 现代药理学研究证明无患子还具有抗菌作用、抗肿瘤、降压和心脏保护作用、保肝作用、免疫调节、抗病毒、镇痛等多种药理作用[2]。无患子总皂苷洗涤液对于汞、锰、福、砷、铅等重金属的洗涤效果明显[3]。无患子总皂苷还是很好的农药乳化剂，对蜗牛、苍蝇、蚊子、棉蚜虫、红蜘蛛等均有较好的杀灭效果[4]。无患子果皮皂苷含量丰富，含量约为5.33%[5]，主要为三萜皂苷类、倍半萜糖苷类，具有较强的表面活性作用[6-7]。明代李时珍在本草纲目中记载：无患子洗头去风明目，洗面增白祛斑。笔者在此主要研究无患子抑制酪氨酸酶[8-9]的作用，筛选美白护肤化妆品天然添加剂。
1材料与方法
1.1试验仪器
JYT2型药物天平（上海医用激光仪器厂）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；WMZK72型指针式电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）；DHG9035A型电热鼓风干燥箱（上海源长实验仪器设备厂）；SY360型超声提取器（上海宁商超生仪器有限公司）；紫外可见分光光度计UV1700PharmaSpec（北京普析通仪器有限公司）。
1.2 试验材料
无患子果皮（2012年9月购于海宁市盐官苗木合作社，产于浙江）；D101型大孔树脂（天津农药厂）；L酪氨酸（日本味之素公司）；酪氨酸酶（25 000单位/mg，sigma公司）；DOPA（购自sigma公司，用PBS缓冲液配制成所需浓度单位）；磷酸缓冲盐（北京化工有限公司）；95%乙醇。
1.3试验方法
1.3.1
无患子总皂苷的提取。
用药物天平称取约为10 g的干燥无患子果皮3份，提取以料液比1∶5分别加入蒸馏水、30%乙醇、60%乙醇各50 ml，提取温度为35 ℃，超声功率为360 W，超声提取时间为30 min/次[10-13]，共3次，合并各组份提取物，烘干称重。
1.3.2
无患子总皂苷大孔树脂吸附富集[14-15]。
1.3.2.1
大孔树脂预处理。取D101树脂用95%乙醇浸泡24 h，湿法装柱，用95%乙醇洗至流出液加5倍量无白色浑浊为止。用纯水洗至中性，备用。
1.3.2.2
大孔树脂吸附富集。
合并无患子总皂苷粗提物，将其按5 g/份取3份，分别放入标号为A、B、C的50 ml烧杯中。加10倍量的水溶解，静置沉淀后过滤，定容至50 ml容量瓶中。准确量取已经预处理的湿树脂200 ml 3份，湿法上3个大孔树脂柱（标号A、B、C），分别上样5 g提取物，依次以蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇各3倍体积量依次洗脱。收集A、B、C 3个大孔树脂柱的水、30%乙醇和70%乙醇各个的洗脱部位置于电热鼓风干燥箱中40 ℃烘干，记录数据，计算平均值得率，合并备用。
1.3.3
酪氨酸酶活性抑制率试验。
酪氨酸酶抑制率按文献[16-17]方法，于475 nm处测吸光度，得出抑制率作比较。按表1准确吸取A、B、C、D 4组反应液，每组设平行3组试管，25 ℃温育5 min立即转移比色皿中于475 nm吸光值。B组空白组，记录A、C、D吸光度值。依据公式计算酪氨酸酶的抑制百分率，即酪氨酸酶的抑制百分率=（A-B）-（C-D）A-B×100%。
2 结果与分析
2.1 无患子总皂苷提取
从表2可以看出，在超声波提取无患子总皂苷提取液过程中，水提得率最高（18.56%），60%乙醇得率最低（14.46%），而30%乙醇提取含量接近水提取得率，为17.85%；色泽上，60%乙醇提取物色泽较深，为棕色，30%乙醇提取物颜色为黄色，而水提取物颜色最浅，为浅黄色。
2.2无患子提取物大孔树脂不同洗脱部位得率
对于大孔树脂富集情况（表3）来看，水洗脱部分占总提取物28.47%，其中主要部分为水溶性物质，不是主要皂苷类成分，30%乙醇提取部分含有约19.84%，属于含糖量大的皂苷类物质，而70%乙醇洗脱部分得率为34.00%，为主要三萜皂苷类，根据文献报道[14]，该部分为主要皂苷类活性成分。 2.3无患子皂苷酪氨酸酶活性抑制结果
通过测试各个不同洗脱部位所配置浓度（0.2 、0.5、1.0 mg/ml）供试品溶液吸光度值，然后计算其各组分对酪氨酸酶抑制率。
从图1可以看出，无患子提取物对酪氨酸酶有很强的抑制作用，其中总提取物、30%乙醇和70%乙醇洗脱组分在1.0 mg/ml浓度上抑制率很强，与熊果酸抑制率相似，而大孔树脂水洗脱组分抑制率较低。
不同浓度提取物对酪氨酸酶抑制作用显著不同，在0.2～1.0 mg/ml范围内随提取物浓度增加抑制率升高，提取物对酪氨酸酶活性抑制效率最高的质量浓度为1.0 mg/ml。70%乙醇大孔树脂洗脱组分抑制率高于30%乙醇组分，表明该部分为主要酪氨酸酶抑制成分，水洗部分抑制率低，该部分成分抑制酪氨酸酶活性不强。
3讨论
通过对水和不同浓度乙醇溶液提取比较，水提得率较高，60%乙醇含量较少，主要原因是无患子果皮中含有较多糖类物质，随着乙醇浓度提高，糖类物质浸出较少，反而以沉淀形式析出。在试验过程中可观察到醇的浓度越高，无患子粗提物的色泽更深，可能皂苷含量更多，或在提取中有部分色素易溶于有机溶剂的缘故。而在后续步骤采取洗脱后的无患子总皂苷进行抑制酪氨酸酶活性试验，超声提取法由于提取温度低、提取时间短，更有利于保留无患子皂苷的生理活性。
在皮肤黑色素生成系列反应中，酪氨酸酶在生物体内具有重要的生理功能，它与人体由于色素沉积而引起的雀斑、褐斑等有关。在酪氨酸酶的作用下，酪氨酸生成还原型多巴，进而氧化成醌式结构，经过系列代谢反应，多巴醌形成多巴色素和5，6二羟基吲哚，然后转化为黑色素[16-17]。因此，抑制酪氨酸酶活性可以起到阻断人体皮肤黑色素形成机制，进而起到皮肤美白的效果。
无患子在民间常用于美白祛斑药物，在抑制酪氨酸-多巴试验中，无患子水提取物经过大孔树脂吸附处理，得到30%乙醇和70%乙醇组分其抑制酪氨酸酶较强，分别为82.29%和84.21%，同时总提取物抑制率也较高（80.23%），以上3种组分具有较强的抑制效果，均與熊果酸抑制率接近，且成分的稳定性好，可以用于美白护肤产品天然提取物添加剂，其主要原因可能是无患子中含有三萜皂苷类、倍半萜糖苷类，对酪氨酸酶有较强的抑制作用，同时也表明该成分是无患子主要成分[14]。无患子作为天然产物，符合当前人们消费理念，欧洲现在开发许多植物提取物作为化妆品添加成分，受到消费者的大力追捧，无患子也将成为不久的将来化妆品中最具有潜力的美白护肤添加剂。
参考文献
[1]
钱志潮.多用途生态树种——无患子[J].浙江林业，2004（7）：16.
[2] 郭英，谢建平，柳爱华，等.无患子药理作用概述[J].中国病原微生物杂志，2011，6（11）：873-874.
[3] 杨玉英，甘荔，耿文奎，等.无患子去皮肤金属沾染洗涤剂毒性研究[J].广西医学，1988，10（6）：339-342.
[4] 周露，谢文申，罗雁婕.川滇无患子提取物用于农药的生物活性研究[J].植物保护，2010（5）：162-164.
[5] 杨志斌，杨柳，李晖.无患子有效化学成分的分析研究[J].湖北林业科技，2010（5）：32-34，68.
[6] 李锐，周燕，杨永成，等.无患子皂苷成分的串联质谱分析[J].高等学校化学学报，2006，27（1）：52-54.
[7] 解辉.无患子总皂苷分离纯化的研究[D].合肥：合肥工业大学，2007.
[8] 陈清西，宋康康.酪氨酸酶的研究进展[J].厦门大学学报，2006，36（5）：731-737.
[9] 张建友，方艳燕，吴晓琴，等.天然活性美白化妆品研究现状及发展前景[J].精细化工，2008，25（1）：72-76.
[10] 魏凤玉，余锦城，解辉.天然无患子皂苷的提取分离[J].安徽化工，2007，33（3）：15-16.
[11] 饶厚曾，郭隆华.无患子皂苷提取工艺的研究[J].江西科学，2002，20（1）：55-58.
[12] 杨安平，蔡小连.无患子总皂苷提取工艺的正交设计优选试验[J].中医药导报，2012，18（6）：74-75.
[13] 赵丹青，苏肇秦，张卫明，等.超声辅助低水比提取无患子皂素工艺过程研究[J].中国野生植物资源，2012，31（4）：18-22.
[14] 傅雷，雷鹏，韩玉梅，等.大孔吸附树脂法制备无患子皂苷及其抑菌菌活性表征[J].中药材，2010，33（2）：267-272.
[15] 南艳平，唐青涛，赵宏伟，等.均匀设计法优化大孔树脂纯化无患子皂苷的的工艺[J].中国医药工业杂志，2012，42（11）：811-814.
[16] 龚盛昭，杨卓如，程江.香草醛对酪氨酸酶活性的抑制[J].华南理工大学学报，2006，34（5）：53-56.
[17] 努尔买买提·艾买提，哈木拉提·吾甫尔.维吾尔医异常粘液质成熟剂体外对蘑菇酪氨酸酶活性的作用[J].中药药理与临床，2006，22（3）：147-149.
[目的]研究无患子总皂苷体外对酪氨酸酶的抑制率。[方法]超声波提取法，溶剂用水、30%乙醇和60%乙醇对无患子总皂苷提取，用大孔树脂（D101）富集水、30%乙醇和70%乙醇部分，紫外分光光度計法，测量酪氨酸酶抑制率。[结果]超声波提取得率中，水提得率（18.56%）最高，60%乙醇提取得率为14.46%，而30%乙醇提取得率为17.85%，接近水提取得率；大孔树脂富集后70%乙醇洗脱部分抑制率高于30%乙醇部分和水部分；与熊果酸比较，70%乙醇洗脱部分、30%乙醇洗脱部分和总皂苷对酪氨酸酶均具有明显的抑制作用。[结论]无患子总皂苷及30%乙醇和70%乙醇大孔树脂洗脱部位对酪氨酸酶抑制率较高，可以作为优良的美白护肤品天然添加剂，应用于生产中。
关键词 无患子；总皂苷；酪氨酸酶；体外；抑制率
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-056-03
基金项目 吉林农业科技学院大学生科技创新科研项目（2014052）。
作者简介
陈雷（1989-），男，吉林松原人，本科生，专业：中药资源与开发。*通讯作者，讲师，硕士，从事中药新药开发研究。
收稿日期20150526
无患子（Sapindus mukurossi Gaertn.）本草纲目中称为木患子，我国产于长江流域以南。无患子具有很强药用价值，其果皮、种子、种仁、根、皮、叶均可以用作医药原材料[1]， 现代药理学研究证明无患子还具有抗菌作用、抗肿瘤、降压和心脏保护作用、保肝作用、免疫调节、抗病毒、镇痛等多种药理作用[2]。无患子总皂苷洗涤液对于汞、锰、福、砷、铅等重金属的洗涤效果明显[3]。无患子总皂苷还是很好的农药乳化剂，对蜗牛、苍蝇、蚊子、棉蚜虫、红蜘蛛等均有较好的杀灭效果[4]。无患子果皮皂苷含量丰富，含量约为5.33%[5]，主要为三萜皂苷类、倍半萜糖苷类，具有较强的表面活性作用[6-7]。明代李时珍在本草纲目中记载：无患子洗头去风明目，洗面增白祛斑。笔者在此主要研究无患子抑制酪氨酸酶[8-9]的作用，筛选美白护肤化妆品天然添加剂。
1材料与方法
1.1试验仪器
JYT2型药物天平（上海医用激光仪器厂）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；WMZK72型指针式电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）；DHG9035A型电热鼓风干燥箱（上海源长实验仪器设备厂）；SY360型超声提取器（上海宁商超生仪器有限公司）；紫外可见分光光度计UV1700PharmaSpec（北京普析通仪器有限公司）。
1.2 试验材料
无患子果皮（2012年9月购于海宁市盐官苗木合作社，产于浙江）；D101型大孔树脂（天津农药厂）；L酪氨酸（日本味之素公司）；酪氨酸酶（25 000单位/mg，sigma公司）；DOPA（购自sigma公司，用PBS缓冲液配制成所需浓度单位）；磷酸缓冲盐（北京化工有限公司）；95%乙醇。
1.3试验方法
1.3.1
无患子总皂苷的提取。
用药物天平称取约为10 g的干燥无患子果皮3份，提取以料液比1∶5分别加入蒸馏水、30%乙醇、60%乙醇各50 ml，提取温度为35 ℃，超声功率为360 W，超声提取时间为30 min/次[10-13]，共3次，合并各组份提取物，烘干称重。
1.3.2
无患子总皂苷大孔树脂吸附富集[14-15]。
1.3.2.1
大孔树脂预处理。取D101树脂用95%乙醇浸泡24 h，湿法装柱，用95%乙醇洗至流出液加5倍量无白色浑浊为止。用纯水洗至中性，备用。
1.3.2.2
大孔树脂吸附富集。
合并无患子总皂苷粗提物，将其按5 g/份取3份，分别放入标号为A、B、C的50 ml烧杯中。加10倍量的水溶解，静置沉淀后过滤，定容至50 ml容量瓶中。准确量取已经预处理的湿树脂200 ml 3份，湿法上3个大孔树脂柱（标号A、B、C），分别上样5 g提取物，依次以蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇各3倍体积量依次洗脱。收集A、B、C 3个大孔树脂柱的水、30%乙醇和70%乙醇各个的洗脱部位置于电热鼓风干燥箱中40 ℃烘干，记录数据，计算平均值得率，合并备用。
1.3.3
酪氨酸酶活性抑制率试验。
酪氨酸酶抑制率按文献[16-17]方法，于475 nm处测吸光度，得出抑制率作比较。按表1准确吸取A、B、C、D 4组反应液，每组设平行3组试管，25 ℃温育5 min立即转移比色皿中于475 nm吸光值。B组空白组，记录A、C、D吸光度值。依据公式计算酪氨酸酶的抑制百分率，即酪氨酸酶的抑制百分率=（A-B）-（C-D）A-B×100%。
2 结果与分析
2.1 无患子总皂苷提取
从表2可以看出，在超声波提取无患子总皂苷提取液过程中，水提得率最高（18.56%），60%乙醇得率最低（14.46%），而30%乙醇提取含量接近水提取得率，为17.85%；色泽上，60%乙醇提取物色泽较深，为棕色，30%乙醇提取物颜色为黄色，而水提取物颜色最浅，为浅黄色。
2.2无患子提取物大孔树脂不同洗脱部位得率
对于大孔树脂富集情况（表3）来看，水洗脱部分占总提取物28.47%，其中主要部分为水溶性物质，不是主要皂苷类成分，30%乙醇提取部分含有约19.84%，属于含糖量大的皂苷类物质，而70%乙醇洗脱部分得率为34.00%，为主要三萜皂苷类，根据文献报道[14]，该部分为主要皂苷类活性成分。 2.3无患子皂苷酪氨酸酶活性抑制结果
通过测试各个不同洗脱部位所配置浓度（0.2 、0.5、1.0 mg/ml）供试品溶液吸光度值，然后计算其各组分对酪氨酸酶抑制率。
从图1可以看出，无患子提取物对酪氨酸酶有很强的抑制作用，其中总提取物、30%乙醇和70%乙醇洗脱组分在1.0 mg/ml浓度上抑制率很强，与熊果酸抑制率相似，而大孔树脂水洗脱组分抑制率较低。
不同浓度提取物对酪氨酸酶抑制作用显著不同，在0.2～1.0 mg/ml范围内随提取物浓度增加抑制率升高，提取物对酪氨酸酶活性抑制效率最高的质量浓度为1.0 mg/ml。70%乙醇大孔树脂洗脱组分抑制率高于30%乙醇组分，表明该部分为主要酪氨酸酶抑制成分，水洗部分抑制率低，该部分成分抑制酪氨酸酶活性不强。
3讨论
通过对水和不同浓度乙醇溶液提取比较，水提得率较高，60%乙醇含量较少，主要原因是无患子果皮中含有较多糖类物质，随着乙醇浓度提高，糖类物质浸出较少，反而以沉淀形式析出。在试验过程中可观察到醇的浓度越高，无患子粗提物的色泽更深，可能皂苷含量更多，或在提取中有部分色素易溶于有机溶剂的缘故。而在后续步骤采取洗脱后的无患子总皂苷进行抑制酪氨酸酶活性试验，超声提取法由于提取温度低、提取时间短，更有利于保留无患子皂苷的生理活性。
在皮肤黑色素生成系列反应中，酪氨酸酶在生物体内具有重要的生理功能，它与人体由于色素沉积而引起的雀斑、褐斑等有关。在酪氨酸酶的作用下，酪氨酸生成还原型多巴，进而氧化成醌式结构，经过系列代谢反应，多巴醌形成多巴色素和5，6二羟基吲哚，然后转化为黑色素[16-17]。因此，抑制酪氨酸酶活性可以起到阻断人体皮肤黑色素形成机制，进而起到皮肤美白的效果。
无患子在民间常用于美白祛斑药物，在抑制酪氨酸-多巴试验中，无患子水提取物经过大孔树脂吸附处理，得到30%乙醇和70%乙醇组分其抑制酪氨酸酶较强，分别为82.29%和84.21%，同时总提取物抑制率也较高（80.23%），以上3种组分具有较强的抑制效果，均與熊果酸抑制率接近，且成分的稳定性好，可以用于美白护肤产品天然提取物添加剂，其主要原因可能是无患子中含有三萜皂苷类、倍半萜糖苷类，对酪氨酸酶有较强的抑制作用，同时也表明该成分是无患子主要成分[14]。无患子作为天然产物，符合当前人们消费理念，欧洲现在开发许多植物提取物作为化妆品添加成分，受到消费者的大力追捧，无患子也将成为不久的将来化妆品中最具有潜力的美白护肤添加剂。
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[7] 解辉.无患子总皂苷分离纯化的研究[D].合肥：合肥工业大学，2007.
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[10] 魏凤玉，余锦城，解辉.天然无患子皂苷的提取分离[J].安徽化工，2007，33（3）：15-16.
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[14] 傅雷，雷鹏，韩玉梅，等.大孔吸附树脂法制备无患子皂苷及其抑菌菌活性表征[J].中药材，2010，33（2）：267-272.
[15] 南艳平，唐青涛，赵宏伟，等.均匀设计法优化大孔树脂纯化无患子皂苷的的工艺[J].中国医药工业杂志，2012，42（11）：811-814.
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