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摘要：目的 优化儿黄缓释双层栓的处方。方法 选择聚乙二醇（PEG）400、PEG4000、羟丙基甲基纤维素（HPMC）的用量为影响因素，采用L9（34）正交试验，以3个不同时间点的累积释放度作为指标，进行综合评分，分别对儿黄缓释双层栓的内层和外层进行优化设计。结果 优选出内层的最优处方为HPMC∶PEG4000∶PEG400=1.5∶10∶4，外层的最优处方为HPMC∶PEG4000∶PEG400=0.5∶10∶4。结论 根据本试验优化处方制备的儿黄缓释双层栓成型性好，并具有良好的缓释作用，对中药栓剂的研究开发具有一定的参考价值。
关键词：儿黄散；缓释双层栓；处方；制备工艺
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.05.023
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）05-0085-04
Abstract：Objective To optimize prescription for double-layered Erhuang sustained-release suppository. Methods Amounts of PEG400， PEG4000， HPMC were selected as influence factors for L9（34） orthogonal experiment. A comprehensive assessment was conducted by setting the cumulative release degree at three different time points as index， and the inner and outer layers of double- layered Erhuang sustained-release suppository were optimized. Results The best prescription was the inner HPMC∶PEG4000∶PEG400=1.5∶10∶4；outer HPMC∶PEG4000∶PEG400=0.5∶10∶4. Conclusion Prescription for double-layered Erhuang sustained-release suppository has good forming property and a good sustained-release effect according to the optimized prescription， which has certain reference value for researches and development of TCM suppository.
Key words：Erhuang Powder；double-layer sustained-release suppository；prescription；preparation technology
儿黄散是黑龙江省名中医王秀霞教授在长期临床实践中总结的治疗宫颈癌的有效方剂，具有活血化瘀、清热解毒、止血消肿、祛腐生肌功效。现代药理研究表明其在体外对宫颈癌Hela细胞生长具有抑制作用，可通过使宫颈癌癌前病变细胞正常化，促进细胞凋亡，从而达到阻断宫颈浸润癌发生的作用[1-3]。但散剂存在给药不方便、易污染衣物、药效持续时间短等缺点。针对此不足，笔者将儿黄散研制开发成以聚乙二醇（PEG）400、PEG4000为基础基质，羟丙基甲基纤维素（HPMC）为缓释材料，具有缓释作用的双层栓剂，并分别通过正交试验对其内层和外层处方进行优化。
1 仪器与试药
AB265-S电子天平，梅特勒公司；ZRS-RG智能溶出试验仪，天津市天大天发科技有限公司；2695-2996型高效液相色谱仪，美国Waters公司。
白及、明矾、儿茶、黄连饮片购自哈药集团世一堂中药饮片有限责任公司，经黑龙江中医药大学中药鉴定教研室孙慧峰副教授鉴定，符合2010年版《中华人民共和国药典》规定；甲醇（色谱纯），美国迪马公司；乙腈（色谱纯），美国迪马公司；PEG400、PEG4000，天津市恒兴化学试剂；HPMC（15k），广州菲瑞新材料有限公司；盐酸小檗碱对照品（批号110713-200911）、儿茶素对照品（批号110877-201102），中国食品药品检定研究院；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 缓释双层栓的制备
取处方量黄连、白及、儿茶、明矾。黄连经乙醇回流提取，提取液回收乙醇并干燥、粉碎，得黄连总生物碱细粉；白及经水提取，提取液用活性炭脱色，减压浓缩后用乙醇醇沉，用盐酸法除蛋白并干燥、粉碎，得白及多糖细粉；儿茶和明矾分别粉碎成细粉后混匀，得儿茶和明矾细粉。采用热熔法制备栓剂，将黄连总生物碱加入熔化的PEG4000、PEG400、HPMC混合基质中，充分搅拌，混匀后倾入预先涂有液状石蜡的栓模中，每孔1.0 g，作为栓剂外层；白及多糖、儿茶和明矾加入含3倍量HPMC相同混合基质中，充分搅拌，混匀后倾入栓模中，作为栓剂内层。室温冷却后刮去溢出部分，取出栓剂[4]。
2.2 指标测定方法
2.2.1 儿黄缓释双层栓释放度的测定 以500 mL 0.1 mol/L盐酸溶液为释放介质，用微孔滤膜包裹转篮，温度（37±0.5）℃，转速100 r/min，分别于不同时间点（内层4、8、12 h，外层0.5、2、4 h）取样2 mL（同时补入等温等量的溶出介质）。外层以黄连中小檗碱为指标，内层以儿茶中儿茶素为指标，采用高效液相色谱法（HPLC）测定，计算累积释放度[4]。 2.2.2 黄连生物碱类成分测定 色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾（50∶50，每100 mL加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调pH至4.0）；检测波长为345 nm；流速为1 mL/min；柱温为30 ℃。
2.2.3 儿茶多酚类成分测定 色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相由甲醇和0.04 mol/L柠檬酸-N，N-二甲基甲酰胺-四氢呋喃（45∶8∶2）组成，二者比例为15∶85（V/V）；柱温为35 ℃；检测波长为280 nm；流速为1 mL/min。
2.3 处方筛选研究
预试验发现HPMC（15k）、PEG4000、PEG400的用量对双层栓成型和释放影响较大，因此分别以其作为影响因素，各取3水平，采用L9（34）正交表设计试验，分别对儿黄缓释双层栓的内层和外层进行优化。
2.3.1 内层处方优化 正交试验因素水平见表1，试验结果见表2，方差分析结果见表3。采用综合评分法[5-10]，先对4、8、12 h 3个时间点的累积释放度进行评分，再将评分结果进行加权相加后得出总分，最后对正交试验结果进行分析。4 h的累积释药量（D4 h）以30%为标准，计算公式为|D4 h-30%|；8 h的累积释药量（D8 h）以60%为标准，计算公式为|D8 h-60%|；12 h的累积释药量（D12 h）以90%为标准，计算公式为|D12 h-90%|。将各时间点的权重均定为1，综合评分（Yi）=|D4 h-30%|×1+|D8 h-60%|×1+|D12 h-90%|×1，其中Dt为t小时的累积释放度，总分最低者为最优，表明释放量与所定标准最接近。
结果表明，A、B因素对试验结果有显著影响，由直观分析可知，影响剂型成型及释放效果的因素顺序为A>B>C，即HPMC（15k）>PEG4000>PEG400。由于因素C的偏差平方和小于误差项因素D，故将其并入误差项计算，PEG400（C）无显著影响，可根据实际情况适当调整。经试验得出A2B2C1为最优条件，即HPMC∶PEG4000∶PEG400=1.5∶10∶4。为保证制剂工艺的重现性和可行性，对优选的最佳处方进行验证，结果见表4。可见，3批样品的综合评分均接近正交试验中的最低分，证明优化处方可行，重现性好，说明筛选出的制剂处方A2B2C1最佳。
2.3.2 外层处方优化 正交试验因素水平见表5，试验结果见表6，方差分析结果见表7。采用综合评分法[5-10]，先对0.5、2、4 h 3个时间点的累积释放度进行评分，再将评分结果进行加权相加后得出总分，最后对正交试验结果进行分析。0.5 h的累积释药量（D0.5 h）以30%为标准，计算公式为|D0.5 h-30%|；2 h的累积释药量（D2 h）以60%为标准，计算公式为|D2 h-60%|；4 h的累积释药量（D4 h）以90%为标准，计算公式为|D4 h-90%|。将各时间点的权重均定为1，综合评分（Yi）=|D0.5 h-30%|×1+|D2 h-60%|×1+|D4 h-90%|×1。其中Dt为t小时的累积释放度，评分值最低者为最优，表明释放量与所定标准最接近。
结果表明，A、C因素对试验结果有显著影响，由直观分析可知，影响剂型成型及释放效果的因素顺序为A>C>B，即HPMC（15k）>PEG400>PEG4000；由于因素B的偏差平方和小于误差项因素D。故将其并入误差项计算，PEG4000（B）无显著影响，可根据实际情况适当调整。经试验观察选取A3B2C1为最优条件，即HPMC∶PEG4000∶PEG400=0.5∶10∶4。为保证制剂工艺的重现性和可行性，对优选的最佳处方进行验证试验，结果见表8。可见，3批样品的综合评分均接近正交试验中的最低分，表明优化处方可行，重现性好，说明筛选出的制剂处方A3B2C1最佳。
3 讨论
中药制剂质量控制正由单指标向多指标、单成分向大类成分（有效部位）的模式进行转变[5-7，11]。本课题组前期研究表明，儿黄缓释双层栓外层黄连总生物碱与各生物碱释放行为相似，内层总多酚与各多酚成分释放行为相似[4]。因此，本研究外层以黄连中小檗碱为指标，内层以儿茶中儿茶素为指标，对儿黄缓释双层栓处方进行优化。
预试验分别筛选了缓释材料卡波姆和HPMC（15k）对双层栓成型和释药的影响。结果表明，HPMC（15k）在成型性方面明显优于卡波姆组。以卡波姆为缓释材料制备的栓剂，在熔融状态下易产生聚团现象，很难分散于PEG类基质中，且注模困难，成品外观粗糙，硬度较小。而以HPMC（15k）为缓释材料制备的栓剂，注模容易，成品外观光滑平整，硬度适中，因此本试验以其为影响因素之一对处方进行优化研究。研究结果表明，优化的处方以HPMC∶PEG4000∶PEG400=1.5∶10∶4为内层（4、8、12 h的累积释放度分别为30%、60%、90%），HPMC∶PEG4000∶PEG400=0.5∶10∶4为外层（0.5、2、4 h的累积释放度分别为30%、60%、90%），既解决了黄连中生物碱类成分易与儿茶中多酚类成分发生配伍变化生成沉淀而影响制剂的成型性的问题，又使药物的释放趋于平稳，从而延长了药效。
参考文献：
[1] 陈海丽，韩凤娟，陈惠铮.儿黄散对Hela细胞病理形态学变化的影响[J].中国妇幼健康研究，2010，2l（3）：342-344.
[2] 韩凤娟，隋丽华，张广美.中医药治疗宫颈上皮内瘤变30例[J].中国中医药信息杂志，2003，10（5）：55-56.
[3] 王建英.儿黄散对宫颈癌Hela细胞凋亡影响的实验研究及对CIN的临床观察[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2009.
[4] 崔殿波，赵永伟，姜继宗，等.儿黄缓释双层栓的体外释药特性研究[J].中成药，2014，36（8）：1619-1625.
[5] 彭常春，郑琴，胡鹏翼，等.复方丹参多元释药双层片的体外释药研究[J].中成药，2010，32（1）：39-43.
[6] 李苑新，袁旭江，朱盛山.复方丹参缓释片多指标成分体外释放度研究[J].中国实验方剂学杂志，2006，12（8）：7-9.
[7] 李苑新，袁旭江，霍务贞，等.复方丹参缓释片总丹酚酸体外释放度的研究[J].中成药，2006，28（5）：636-638.
[8] 张继稳，陈立兵，顾景凯，等.多组分中药化合物组释放同步性评价方法[J].药学学报，2008，43（6）：647-651.
[9] 何心，石春伟，张闯，等.复方甲硝唑缓释栓的制备及体外释放度考察[J].中国药房，2011，22（9）：834-836.
[10] 赵泉，梁延平，霍雪臣，等.阿奇霉素缓释阴道栓的处方优化[J].中国药房，2009，20（31）：2437-2438.
[11] 熊英，徐振岳，关旭久.淫羊藿总黄酮缓释片处方工艺研究[J].中医药学刊，2005，23（12）：2270-2271.
（收稿日期：2014-09-30）
（修回日期：2014-10-14；编辑：陈静）
关键词：儿黄散；缓释双层栓；处方；制备工艺
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.05.023
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）05-0085-04
Abstract：Objective To optimize prescription for double-layered Erhuang sustained-release suppository. Methods Amounts of PEG400， PEG4000， HPMC were selected as influence factors for L9（34） orthogonal experiment. A comprehensive assessment was conducted by setting the cumulative release degree at three different time points as index， and the inner and outer layers of double- layered Erhuang sustained-release suppository were optimized. Results The best prescription was the inner HPMC∶PEG4000∶PEG400=1.5∶10∶4；outer HPMC∶PEG4000∶PEG400=0.5∶10∶4. Conclusion Prescription for double-layered Erhuang sustained-release suppository has good forming property and a good sustained-release effect according to the optimized prescription， which has certain reference value for researches and development of TCM suppository.
Key words：Erhuang Powder；double-layer sustained-release suppository；prescription；preparation technology
儿黄散是黑龙江省名中医王秀霞教授在长期临床实践中总结的治疗宫颈癌的有效方剂，具有活血化瘀、清热解毒、止血消肿、祛腐生肌功效。现代药理研究表明其在体外对宫颈癌Hela细胞生长具有抑制作用，可通过使宫颈癌癌前病变细胞正常化，促进细胞凋亡，从而达到阻断宫颈浸润癌发生的作用[1-3]。但散剂存在给药不方便、易污染衣物、药效持续时间短等缺点。针对此不足，笔者将儿黄散研制开发成以聚乙二醇（PEG）400、PEG4000为基础基质，羟丙基甲基纤维素（HPMC）为缓释材料，具有缓释作用的双层栓剂，并分别通过正交试验对其内层和外层处方进行优化。
1 仪器与试药
AB265-S电子天平，梅特勒公司；ZRS-RG智能溶出试验仪，天津市天大天发科技有限公司；2695-2996型高效液相色谱仪，美国Waters公司。
白及、明矾、儿茶、黄连饮片购自哈药集团世一堂中药饮片有限责任公司，经黑龙江中医药大学中药鉴定教研室孙慧峰副教授鉴定，符合2010年版《中华人民共和国药典》规定；甲醇（色谱纯），美国迪马公司；乙腈（色谱纯），美国迪马公司；PEG400、PEG4000，天津市恒兴化学试剂；HPMC（15k），广州菲瑞新材料有限公司；盐酸小檗碱对照品（批号110713-200911）、儿茶素对照品（批号110877-201102），中国食品药品检定研究院；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 缓释双层栓的制备
取处方量黄连、白及、儿茶、明矾。黄连经乙醇回流提取，提取液回收乙醇并干燥、粉碎，得黄连总生物碱细粉；白及经水提取，提取液用活性炭脱色，减压浓缩后用乙醇醇沉，用盐酸法除蛋白并干燥、粉碎，得白及多糖细粉；儿茶和明矾分别粉碎成细粉后混匀，得儿茶和明矾细粉。采用热熔法制备栓剂，将黄连总生物碱加入熔化的PEG4000、PEG400、HPMC混合基质中，充分搅拌，混匀后倾入预先涂有液状石蜡的栓模中，每孔1.0 g，作为栓剂外层；白及多糖、儿茶和明矾加入含3倍量HPMC相同混合基质中，充分搅拌，混匀后倾入栓模中，作为栓剂内层。室温冷却后刮去溢出部分，取出栓剂[4]。
2.2 指标测定方法
2.2.1 儿黄缓释双层栓释放度的测定 以500 mL 0.1 mol/L盐酸溶液为释放介质，用微孔滤膜包裹转篮，温度（37±0.5）℃，转速100 r/min，分别于不同时间点（内层4、8、12 h，外层0.5、2、4 h）取样2 mL（同时补入等温等量的溶出介质）。外层以黄连中小檗碱为指标，内层以儿茶中儿茶素为指标，采用高效液相色谱法（HPLC）测定，计算累积释放度[4]。 2.2.2 黄连生物碱类成分测定 色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾（50∶50，每100 mL加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调pH至4.0）；检测波长为345 nm；流速为1 mL/min；柱温为30 ℃。
2.2.3 儿茶多酚类成分测定 色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相由甲醇和0.04 mol/L柠檬酸-N，N-二甲基甲酰胺-四氢呋喃（45∶8∶2）组成，二者比例为15∶85（V/V）；柱温为35 ℃；检测波长为280 nm；流速为1 mL/min。
2.3 处方筛选研究
预试验发现HPMC（15k）、PEG4000、PEG400的用量对双层栓成型和释放影响较大，因此分别以其作为影响因素，各取3水平，采用L9（34）正交表设计试验，分别对儿黄缓释双层栓的内层和外层进行优化。
2.3.1 内层处方优化 正交试验因素水平见表1，试验结果见表2，方差分析结果见表3。采用综合评分法[5-10]，先对4、8、12 h 3个时间点的累积释放度进行评分，再将评分结果进行加权相加后得出总分，最后对正交试验结果进行分析。4 h的累积释药量（D4 h）以30%为标准，计算公式为|D4 h-30%|；8 h的累积释药量（D8 h）以60%为标准，计算公式为|D8 h-60%|；12 h的累积释药量（D12 h）以90%为标准，计算公式为|D12 h-90%|。将各时间点的权重均定为1，综合评分（Yi）=|D4 h-30%|×1+|D8 h-60%|×1+|D12 h-90%|×1，其中Dt为t小时的累积释放度，总分最低者为最优，表明释放量与所定标准最接近。
结果表明，A、B因素对试验结果有显著影响，由直观分析可知，影响剂型成型及释放效果的因素顺序为A>B>C，即HPMC（15k）>PEG4000>PEG400。由于因素C的偏差平方和小于误差项因素D，故将其并入误差项计算，PEG400（C）无显著影响，可根据实际情况适当调整。经试验得出A2B2C1为最优条件，即HPMC∶PEG4000∶PEG400=1.5∶10∶4。为保证制剂工艺的重现性和可行性，对优选的最佳处方进行验证，结果见表4。可见，3批样品的综合评分均接近正交试验中的最低分，证明优化处方可行，重现性好，说明筛选出的制剂处方A2B2C1最佳。
2.3.2 外层处方优化 正交试验因素水平见表5，试验结果见表6，方差分析结果见表7。采用综合评分法[5-10]，先对0.5、2、4 h 3个时间点的累积释放度进行评分，再将评分结果进行加权相加后得出总分，最后对正交试验结果进行分析。0.5 h的累积释药量（D0.5 h）以30%为标准，计算公式为|D0.5 h-30%|；2 h的累积释药量（D2 h）以60%为标准，计算公式为|D2 h-60%|；4 h的累积释药量（D4 h）以90%为标准，计算公式为|D4 h-90%|。将各时间点的权重均定为1，综合评分（Yi）=|D0.5 h-30%|×1+|D2 h-60%|×1+|D4 h-90%|×1。其中Dt为t小时的累积释放度，评分值最低者为最优，表明释放量与所定标准最接近。
结果表明，A、C因素对试验结果有显著影响，由直观分析可知，影响剂型成型及释放效果的因素顺序为A>C>B，即HPMC（15k）>PEG400>PEG4000；由于因素B的偏差平方和小于误差项因素D。故将其并入误差项计算，PEG4000（B）无显著影响，可根据实际情况适当调整。经试验观察选取A3B2C1为最优条件，即HPMC∶PEG4000∶PEG400=0.5∶10∶4。为保证制剂工艺的重现性和可行性，对优选的最佳处方进行验证试验，结果见表8。可见，3批样品的综合评分均接近正交试验中的最低分，表明优化处方可行，重现性好，说明筛选出的制剂处方A3B2C1最佳。
3 讨论
中药制剂质量控制正由单指标向多指标、单成分向大类成分（有效部位）的模式进行转变[5-7，11]。本课题组前期研究表明，儿黄缓释双层栓外层黄连总生物碱与各生物碱释放行为相似，内层总多酚与各多酚成分释放行为相似[4]。因此，本研究外层以黄连中小檗碱为指标，内层以儿茶中儿茶素为指标，对儿黄缓释双层栓处方进行优化。
预试验分别筛选了缓释材料卡波姆和HPMC（15k）对双层栓成型和释药的影响。结果表明，HPMC（15k）在成型性方面明显优于卡波姆组。以卡波姆为缓释材料制备的栓剂，在熔融状态下易产生聚团现象，很难分散于PEG类基质中，且注模困难，成品外观粗糙，硬度较小。而以HPMC（15k）为缓释材料制备的栓剂，注模容易，成品外观光滑平整，硬度适中，因此本试验以其为影响因素之一对处方进行优化研究。研究结果表明，优化的处方以HPMC∶PEG4000∶PEG400=1.5∶10∶4为内层（4、8、12 h的累积释放度分别为30%、60%、90%），HPMC∶PEG4000∶PEG400=0.5∶10∶4为外层（0.5、2、4 h的累积释放度分别为30%、60%、90%），既解决了黄连中生物碱类成分易与儿茶中多酚类成分发生配伍变化生成沉淀而影响制剂的成型性的问题，又使药物的释放趋于平稳，从而延长了药效。
参考文献：
[1] 陈海丽，韩凤娟，陈惠铮.儿黄散对Hela细胞病理形态学变化的影响[J].中国妇幼健康研究，2010，2l（3）：342-344.
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[3] 王建英.儿黄散对宫颈癌Hela细胞凋亡影响的实验研究及对CIN的临床观察[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2009.
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[6] 李苑新，袁旭江，朱盛山.复方丹参缓释片多指标成分体外释放度研究[J].中国实验方剂学杂志，2006，12（8）：7-9.
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[8] 张继稳，陈立兵，顾景凯，等.多组分中药化合物组释放同步性评价方法[J].药学学报，2008，43（6）：647-651.
[9] 何心，石春伟，张闯，等.复方甲硝唑缓释栓的制备及体外释放度考察[J].中国药房，2011，22（9）：834-836.
[10] 赵泉，梁延平，霍雪臣，等.阿奇霉素缓释阴道栓的处方优化[J].中国药房，2009，20（31）：2437-2438.
[11] 熊英，徐振岳，关旭久.淫羊藿总黄酮缓释片处方工艺研究[J].中医药学刊，2005，23（12）：2270-2271.
（收稿日期：2014-09-30）
（修回日期：2014-10-14；编辑：陈静）