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【摘 要】目的：通过对实验室培养的C6/36细胞中的浓核病毒的提取，检测浓核病毒是否存在并研究其与蚊媒病毒所感染细胞的关系。方法：通过对正常C6/36细胞、疑似潜伏浓核病毒细胞、未感染病毒且出现CPE细胞、蚊媒病毒感染C6/36细胞进行浓核病毒DNA提取和检测，使用特异性引物扩增后测序比对，证明浓核病毒的存在。结果：成功的从样本中提取出浓核病毒DNA 结论：浓核病毒在C6/36细胞中广泛存在并且在受到病毒感染时会大量增殖。同时可能引起C6/36细胞对病毒敏感性降低，利用这一特性可以利用浓核病毒对蚊媒以及蚊媒病毒进行生物防治。
【关键词】C6/36细胞；浓核病毒；蚊媒病毒；生物防治。
【中图分类号】R373 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2013）04-0178-02
白纹伊蚊细胞（C6/36）是实验室中增殖蚊媒病毒的常用细胞，常首先通过观察CPE来评价病毒增殖情况。但有时会出现接种病毒的细胞样本CPE不明显、同种细胞CPE不同、虽有CPE出现但病毒含量检测结果显示病毒增殖受到抑制等情况。有报道C6/36细胞中可能潜伏伊蚊浓核病毒（Densonucleosis virus，DNV）[1] 这种单链DNA病毒在宿主细胞未被登革热病毒感染时，往往不影响细胞的正常生长与传代。当细胞受到登革热病毒感染时，这种病毒则大量繁殖，从而引起宿主细胞的变化甚至死亡同时抑制其他病毒的增殖。
本实验室在利用C6/36细胞对病毒进行培养时，观察到接种病毒的C6/36细胞发生明显CPE但几乎无法检测到病毒并且同为黄病属的病毒引起CPE不尽相同，在证实其未污染或被其他病毒感染后，怀疑可能存在浓核病毒。通过检测C6/36细胞中的浓核病毒探讨其与各种病毒感染细胞后的变化的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞、病毒
白纹伊蚊C6/36细胞由南京医科大学朱昌亮教授馈赠，乙型脑炎、黄热病病毒样本为实验室培养，登革I、II型热病毒株来自福建出入境检验检疫局。
1.1.2 试剂盒主要仪器
本实验所用的PCR扩增所需试剂购自TaKaRa公司；DMEM培养液购于GIBCO公司；QIAgenDNA/ RNA Mini Kit购自德国QIAGEN公司；引物由上海Invitrogen公司合成。所用仪器有美国ABI公司产Veriti PCR扩增仪等。
1.2 方 法
1.2.1 细胞培养
选用10%胎牛血清的DMEM高糖培养液对C6/36进行培养，2-3d换液，4-5d生长至80%左右常规传代。
1.2.2 病毒增殖
选用生长为单层的细胞，提前一日换液，200μl病毒液吸附1h后补加1800μl培养液，每日观察CPE情况，细胞病变达++时同时收集不感染病毒、感染乙型脑炎病毒、登革热病毒和黄热病毒的C6/36细胞，液氮冻存。
1.2.3 DNA的提取
分别收集未感染病毒，感染乙型脑炎病毒、黄热病毒和登革热病毒的C6/36细胞样本。反复冻融后收集病毒培养液经过细菌过滤器过滤（滤膜为250nm）后进行DNA的提取。未感染病毒的细胞样本直接提取DNA。DNA提取参照QIAgenDNA/ RNA Mini Kit核酸提取试剂盒说明书。
2.3 测序比对
采用引物序列进行正、反向测序并已知序列进行相似性分析，测序结果在GenBank中BLAST，结果所测得序列与白纹伊蚊C6/36细胞浓核病毒非结构蛋白1段的核苷酸同源性为99%。
3 结论
细小病毒科是动物病毒中最小最简单的一类DNA病毒[2]，蚊浓核病毒是其中重要的一种，它能够感染蚊类并在特殊情况下引发特异性的细胞核致密增生并最終导致宿主病变和死亡[7]。有资料表明DNV C6/36 能抑制Ⅱ型登革热病毒的复制，而Ⅱ型登革热病毒能促进DNV C6/36的复制[6]。这为利用浓核病毒进行杀虫剂以及病毒的生物防治研究提供了依据。
由于实验结果证明正常 C6/36细胞和多株病变细胞均出现白纹伊蚊C6/36细胞浓核病毒扩增结果呈阳性，有理由相信DNV是一种潜伏于正常C6/36 细胞中的病毒，证明自然界的蚊虫中可能广泛存在DNV的感染。同时有资料表明感染DNV的C3/36细胞对登革病毒的易感性降低，这表明DNV可能诱导一种异源性的抗病毒状态[5]。相信利用浓核病毒进行生物防治将在不远的将来实现[8]。
参考文献：
[1] 朱其太，蔡锡平. 新的动物病毒简介[ J]. 中国兽医杂志，1999（11）：44-47
[2] Kerr J R，Cotmore S F，Bloom M E，et al . Parvovirus[M]. Oxford： Oxford University Press，2006.
[3] Wei W，Shao D，Huang X，et al . American Journal of Tropical Medicine and Hygiene[J]，2006，75（6）： 1118-1126
[4] 郑夔，黄吉城等.南方五省口岸蚊类携带虫媒病毒调查[M]. 中国国境卫生检疫杂志，2009，32（3）：181-186.
[5] Burivong.P.，S.N.Pattanakitsakul，et a1. Markedly reduced severity of Dengue virus infection in mosquito cell cultures persistently infected with Aedes albopictus densovrus[J]Virology，2004，329（2）：261-269.
[6] 包方，姚勤，李军，等.昆虫学报[J]，2008，50（12）： 1219-1224.
[7] 张勤奋，陈雄森，邓莹，等.伊蚊培养细胞中发现的一株新浓核病毒[ J]. 电子显微学报，2002（5）： 553- 554。
[8] 顾金宝，陈晓光.蚊浓核病毒的研究进展[J]. 热带医学杂志，2008，8（8）：869-872.
作者简介：
吴昊（1988—），男，河南人，在读硕士，主要从事分子免疫及分子生物学研究。
【关键词】C6/36细胞；浓核病毒；蚊媒病毒；生物防治。
【中图分类号】R373 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2013）04-0178-02
白纹伊蚊细胞（C6/36）是实验室中增殖蚊媒病毒的常用细胞，常首先通过观察CPE来评价病毒增殖情况。但有时会出现接种病毒的细胞样本CPE不明显、同种细胞CPE不同、虽有CPE出现但病毒含量检测结果显示病毒增殖受到抑制等情况。有报道C6/36细胞中可能潜伏伊蚊浓核病毒（Densonucleosis virus，DNV）[1] 这种单链DNA病毒在宿主细胞未被登革热病毒感染时，往往不影响细胞的正常生长与传代。当细胞受到登革热病毒感染时，这种病毒则大量繁殖，从而引起宿主细胞的变化甚至死亡同时抑制其他病毒的增殖。
本实验室在利用C6/36细胞对病毒进行培养时，观察到接种病毒的C6/36细胞发生明显CPE但几乎无法检测到病毒并且同为黄病属的病毒引起CPE不尽相同，在证实其未污染或被其他病毒感染后，怀疑可能存在浓核病毒。通过检测C6/36细胞中的浓核病毒探讨其与各种病毒感染细胞后的变化的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞、病毒
白纹伊蚊C6/36细胞由南京医科大学朱昌亮教授馈赠，乙型脑炎、黄热病病毒样本为实验室培养，登革I、II型热病毒株来自福建出入境检验检疫局。
1.1.2 试剂盒主要仪器
本实验所用的PCR扩增所需试剂购自TaKaRa公司；DMEM培养液购于GIBCO公司；QIAgenDNA/ RNA Mini Kit购自德国QIAGEN公司；引物由上海Invitrogen公司合成。所用仪器有美国ABI公司产Veriti PCR扩增仪等。
1.2 方 法
1.2.1 细胞培养
选用10%胎牛血清的DMEM高糖培养液对C6/36进行培养，2-3d换液，4-5d生长至80%左右常规传代。
1.2.2 病毒增殖
选用生长为单层的细胞，提前一日换液，200μl病毒液吸附1h后补加1800μl培养液，每日观察CPE情况，细胞病变达++时同时收集不感染病毒、感染乙型脑炎病毒、登革热病毒和黄热病毒的C6/36细胞，液氮冻存。
1.2.3 DNA的提取
分别收集未感染病毒，感染乙型脑炎病毒、黄热病毒和登革热病毒的C6/36细胞样本。反复冻融后收集病毒培养液经过细菌过滤器过滤（滤膜为250nm）后进行DNA的提取。未感染病毒的细胞样本直接提取DNA。DNA提取参照QIAgenDNA/ RNA Mini Kit核酸提取试剂盒说明书。
2.3 测序比对
采用引物序列进行正、反向测序并已知序列进行相似性分析，测序结果在GenBank中BLAST，结果所测得序列与白纹伊蚊C6/36细胞浓核病毒非结构蛋白1段的核苷酸同源性为99%。
3 结论
细小病毒科是动物病毒中最小最简单的一类DNA病毒[2]，蚊浓核病毒是其中重要的一种，它能够感染蚊类并在特殊情况下引发特异性的细胞核致密增生并最終导致宿主病变和死亡[7]。有资料表明DNV C6/36 能抑制Ⅱ型登革热病毒的复制，而Ⅱ型登革热病毒能促进DNV C6/36的复制[6]。这为利用浓核病毒进行杀虫剂以及病毒的生物防治研究提供了依据。
由于实验结果证明正常 C6/36细胞和多株病变细胞均出现白纹伊蚊C6/36细胞浓核病毒扩增结果呈阳性，有理由相信DNV是一种潜伏于正常C6/36 细胞中的病毒，证明自然界的蚊虫中可能广泛存在DNV的感染。同时有资料表明感染DNV的C3/36细胞对登革病毒的易感性降低，这表明DNV可能诱导一种异源性的抗病毒状态[5]。相信利用浓核病毒进行生物防治将在不远的将来实现[8]。
参考文献：
[1] 朱其太，蔡锡平. 新的动物病毒简介[ J]. 中国兽医杂志，1999（11）：44-47
[2] Kerr J R，Cotmore S F，Bloom M E，et al . Parvovirus[M]. Oxford： Oxford University Press，2006.
[3] Wei W，Shao D，Huang X，et al . American Journal of Tropical Medicine and Hygiene[J]，2006，75（6）： 1118-1126
[4] 郑夔，黄吉城等.南方五省口岸蚊类携带虫媒病毒调查[M]. 中国国境卫生检疫杂志，2009，32（3）：181-186.
[5] Burivong.P.，S.N.Pattanakitsakul，et a1. Markedly reduced severity of Dengue virus infection in mosquito cell cultures persistently infected with Aedes albopictus densovrus[J]Virology，2004，329（2）：261-269.
[6] 包方，姚勤，李军，等.昆虫学报[J]，2008，50（12）： 1219-1224.
[7] 张勤奋，陈雄森，邓莹，等.伊蚊培养细胞中发现的一株新浓核病毒[ J]. 电子显微学报，2002（5）： 553- 554。
[8] 顾金宝，陈晓光.蚊浓核病毒的研究进展[J]. 热带医学杂志，2008，8（8）：869-872.
作者简介：
吴昊（1988—），男，河南人，在读硕士，主要从事分子免疫及分子生物学研究。