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摘要：以壳聚糖为载体固定化胰蛋白酶，制备牡蛎肽，然后以肽得率为指标，分别研究了pH值，酶加量，酶解时间和温度等单因子对固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白质的影响。实验结果表明，酶解牡蛎蛋白的最佳工艺条件是：底物浓度为200 μg/mL，加固定化胰蛋白酶量7 mg/3 mL，酶解时间3 h，pH 8.0，温度40 ℃。在此条件下水解牡蛎蛋白，肽得率可达到20.39%。
关键词：壳聚糖；固定化；胰蛋白酶；牡蛎；肽
牡蛎（Crassostrea gigas）是我国重要的养殖贝类品种。牡蛎具有丰富的营养，还有一定的药用价值。近年的研究表明，牡蛎肽具有多种多样的生物活性。Wang等利用枯草杆菌蛋白酶从牡蛎中制备的牡蛎肽具有抗氧化活性，经过HPLC分离获得了抗氧化活性牡蛎肽PVMGD和QHGV[1]。其它的还有刺激免疫细胞增加IL-2作用、抑制ACE酶活性以及抗菌活性[2-4]。因此牡蛎肽是一种重要的生物活性物质，可以应用于保健食品领域。
酶解法是制备肽的常用方法，固定化酶的方法也是常用的酶解工艺[5]。固定化酶具有可以重复使用、生产成本低的优点。本文以肽得率为指标，研究利用壳聚糖固定化胰蛋白酶制备牡蛎肽的最佳工艺条件。研究结果将为牡蛎肽的制备提供一些有益的数据。
1材料与方法
1.1材料
牡蛎购于大连长兴农贸市场。
胰蛋白酶（1：250）购于北京索莱宝科技有限公司；壳聚糖购于浙江金壳生物化学有限公司。其他试剂为国产分析纯试剂。
1.2方法
1.2.1固定化胰蛋白酶的制备按张金铃等的方法进行壳聚糖固定胰蛋白酶的制备[5]。在0.2 g壳聚糖上固定了20 mg的胰蛋白酶，活力为314 U。
1.2.2牡蛎肽的制备取新鲜牡蛎，去除内脏，加入0.9%的NaCl溶液并进行匀浆，置于4 ℃抽提过夜。在4 000 r/min条件下离心20 min，获得上清液。
将一定量的壳聚糖固定胰蛋白酶加入到上清液中进行酶解，在不同底物浓度、温度、pH、加固定化胰蛋白酶量以及时间等条件下，测定肽得率。
1.2.3肽得率测定采用Folin-酚法测定上清液中的蛋白含量。酶解液经三氯乙酸（TCA）沉淀后，上清部分用Folin-酚法测定，即是肽的含量。肽得率（%）=上清液肽含量/蛋白含量。
2结果与讨论
2.1不同的壳聚糖固定胰蛋白酶加酶量对牡蛎蛋白酶解反应的影响
在pH8.0的3 mL底物质量浓度为200 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，分别加入3、4、5、6、7、8 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图1。由图1可知，随着固定化胰蛋白酶量的增加，肽得率逐渐升高，且在固定化胰蛋白酶用量为6 mg/3 mL后，肽得率增加较慢。
2.2pH对牡蛎蛋白酶解反应的影响
在pH分别为5、6、7、8的3 mL底物质量浓度为200 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，各加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图2。由图2可知，随着pH值的增加，肽得率先升高后降低，且在pH值为8时，肽得率最大。
2.3温度对牡蛎蛋白酶解反应的影响
在pH 8.0的3 mL底物质量浓度为200 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，分别于25、30、35、40、45、50、55 ℃水浴酶解4 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图3。由图3可知，随着酶解温度的增加，肽得率先升高后降低，且在温度值为40 ℃，肽得率最大。
2.4底物浓度对牡蛎蛋白酶解反应的影响
在pH 8.0的3 mL底物质量浓度分别为100、150、200、250、300 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图4。由图4可知，随着底物浓度的增加，肽得率逐渐升高，且在底物质量浓度为200 μg/mL后，肽得率增加较慢。
2.5酶解时间对菲律宾蛤仔酶解反应的影响
在pH 8.0的3 mL底物质量浓度为200 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃分别水浴酶解1、2、3、4、5、6 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图5。由图5可知，随着酶解时间的延长，肽得率逐渐升高，且在3 h后，肽得率增加较慢。
2.6壳聚糖固定胰蛋白酶最佳水解条件的确定
影响酶解反应的几个主要因素为固定化酶量、酶解时间、pH、温度和底物浓度。根据上述单因素试验分析，并考虑生产成本等因素，酶解温度40 ℃，底物浓度200 μg/mL，以肽得率为指标做壳聚糖固定胰蛋白酶量、pH、酶解时间3因素3水平的正交试验L9 （33 ），正交试验的因素水平见表1，正交试验结果见表2。
1.32由表2可知，各因素对壳聚糖固定胰蛋白酶酶解菲律宾蛤仔蛋白的肽得率影响大小顺序为A>B>C，即：酶加量>pH>酶解时间，最优水平为A3B3C2，即：pH为8.0，壳聚糖固定胰蛋白酶量为7 mg/3 mL，酶解时间3 h。
因此确定壳聚糖固定胰蛋白酶酶解菲律宾蛤仔低分子量蛋白的最佳条件为酶加量7 mg/3 mL，时间3 h，pH 8.0，温度40 ℃，底物浓度为200 μg/mL。在此条件下水解牡蛎蛋白，肽得率可达到20.39%。
3结论
壳聚糖固定胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白的最佳条件为酶加量7 mg/3 mL，时间3 h，pH 8.0，温度40 ℃，底物浓度为200 μg/mL。在此条件下水解牡蛎蛋白，肽得率可达到20.39%。 参考文献：
[1] Wang Q.， Li W.， He Y.， Ren D.， Kow F.， Song L.， Yu X. Novel antioxidative peptides from the protein hydrolysate of oysters （Crassostrea talienwhanensis） [J]. Food Chemistry， 2014， 145： 991-996
[2] Achour A.， Lachgar A.， Astgen A.， Chams V.， Bizzini B.， Tapiero H.， Zagury D. Potentialization of IL-2 effects on immune cells by oyster extract （JCOE） in normal and HIV-infected individuals[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 1997， 51（10）： 427-429
[3] Shiozaki K.， Shiozaki M.， Masuda J.， Yamauchi A.， Ohwada S.， Nakano T.， Yamaguchi T.， Saito T.， Muramoto K.， Sato M. Identification of oyster-derived hypotensive peptide acting as angiotensin-I-converting enzyme inhibitor[J]. Fisheries Science， 2010， 76（5）： 865-872
[4] Anderson R.S.， Beaven A.E. Antibacterial activities of oyster （Crassostrea virginica） and mussel （Myrillus edulis and Geukensia demissa） plasma[J]. Aquatic living resources，2001，14（6）： 343-349
[5] 张金铃， 迟海， 李伟， 等.壳聚糖固定化胰蛋白酶制备魁蚶肽的研究[J].水产科学， 2010， 29（9）： 553-555
关键词：壳聚糖；固定化；胰蛋白酶；牡蛎；肽
牡蛎（Crassostrea gigas）是我国重要的养殖贝类品种。牡蛎具有丰富的营养，还有一定的药用价值。近年的研究表明，牡蛎肽具有多种多样的生物活性。Wang等利用枯草杆菌蛋白酶从牡蛎中制备的牡蛎肽具有抗氧化活性，经过HPLC分离获得了抗氧化活性牡蛎肽PVMGD和QHGV[1]。其它的还有刺激免疫细胞增加IL-2作用、抑制ACE酶活性以及抗菌活性[2-4]。因此牡蛎肽是一种重要的生物活性物质，可以应用于保健食品领域。
酶解法是制备肽的常用方法，固定化酶的方法也是常用的酶解工艺[5]。固定化酶具有可以重复使用、生产成本低的优点。本文以肽得率为指标，研究利用壳聚糖固定化胰蛋白酶制备牡蛎肽的最佳工艺条件。研究结果将为牡蛎肽的制备提供一些有益的数据。
1材料与方法
1.1材料
牡蛎购于大连长兴农贸市场。
胰蛋白酶（1：250）购于北京索莱宝科技有限公司；壳聚糖购于浙江金壳生物化学有限公司。其他试剂为国产分析纯试剂。
1.2方法
1.2.1固定化胰蛋白酶的制备按张金铃等的方法进行壳聚糖固定胰蛋白酶的制备[5]。在0.2 g壳聚糖上固定了20 mg的胰蛋白酶，活力为314 U。
1.2.2牡蛎肽的制备取新鲜牡蛎，去除内脏，加入0.9%的NaCl溶液并进行匀浆，置于4 ℃抽提过夜。在4 000 r/min条件下离心20 min，获得上清液。
将一定量的壳聚糖固定胰蛋白酶加入到上清液中进行酶解，在不同底物浓度、温度、pH、加固定化胰蛋白酶量以及时间等条件下，测定肽得率。
1.2.3肽得率测定采用Folin-酚法测定上清液中的蛋白含量。酶解液经三氯乙酸（TCA）沉淀后，上清部分用Folin-酚法测定，即是肽的含量。肽得率（%）=上清液肽含量/蛋白含量。
2结果与讨论
2.1不同的壳聚糖固定胰蛋白酶加酶量对牡蛎蛋白酶解反应的影响
在pH8.0的3 mL底物质量浓度为200 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，分别加入3、4、5、6、7、8 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图1。由图1可知，随着固定化胰蛋白酶量的增加，肽得率逐渐升高，且在固定化胰蛋白酶用量为6 mg/3 mL后，肽得率增加较慢。
2.2pH对牡蛎蛋白酶解反应的影响
在pH分别为5、6、7、8的3 mL底物质量浓度为200 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，各加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图2。由图2可知，随着pH值的增加，肽得率先升高后降低，且在pH值为8时，肽得率最大。
2.3温度对牡蛎蛋白酶解反应的影响
在pH 8.0的3 mL底物质量浓度为200 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，分别于25、30、35、40、45、50、55 ℃水浴酶解4 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图3。由图3可知，随着酶解温度的增加，肽得率先升高后降低，且在温度值为40 ℃，肽得率最大。
2.4底物浓度对牡蛎蛋白酶解反应的影响
在pH 8.0的3 mL底物质量浓度分别为100、150、200、250、300 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图4。由图4可知，随着底物浓度的增加，肽得率逐渐升高，且在底物质量浓度为200 μg/mL后，肽得率增加较慢。
2.5酶解时间对菲律宾蛤仔酶解反应的影响
在pH 8.0的3 mL底物质量浓度为200 μg/mL的牡蛎蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃分别水浴酶解1、2、3、4、5、6 h，测得的固定化胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白结果见图5。由图5可知，随着酶解时间的延长，肽得率逐渐升高，且在3 h后，肽得率增加较慢。
2.6壳聚糖固定胰蛋白酶最佳水解条件的确定
影响酶解反应的几个主要因素为固定化酶量、酶解时间、pH、温度和底物浓度。根据上述单因素试验分析，并考虑生产成本等因素，酶解温度40 ℃，底物浓度200 μg/mL，以肽得率为指标做壳聚糖固定胰蛋白酶量、pH、酶解时间3因素3水平的正交试验L9 （33 ），正交试验的因素水平见表1，正交试验结果见表2。
1.32由表2可知，各因素对壳聚糖固定胰蛋白酶酶解菲律宾蛤仔蛋白的肽得率影响大小顺序为A>B>C，即：酶加量>pH>酶解时间，最优水平为A3B3C2，即：pH为8.0，壳聚糖固定胰蛋白酶量为7 mg/3 mL，酶解时间3 h。
因此确定壳聚糖固定胰蛋白酶酶解菲律宾蛤仔低分子量蛋白的最佳条件为酶加量7 mg/3 mL，时间3 h，pH 8.0，温度40 ℃，底物浓度为200 μg/mL。在此条件下水解牡蛎蛋白，肽得率可达到20.39%。
3结论
壳聚糖固定胰蛋白酶酶解牡蛎蛋白的最佳条件为酶加量7 mg/3 mL，时间3 h，pH 8.0，温度40 ℃，底物浓度为200 μg/mL。在此条件下水解牡蛎蛋白，肽得率可达到20.39%。 参考文献：
[1] Wang Q.， Li W.， He Y.， Ren D.， Kow F.， Song L.， Yu X. Novel antioxidative peptides from the protein hydrolysate of oysters （Crassostrea talienwhanensis） [J]. Food Chemistry， 2014， 145： 991-996
[2] Achour A.， Lachgar A.， Astgen A.， Chams V.， Bizzini B.， Tapiero H.， Zagury D. Potentialization of IL-2 effects on immune cells by oyster extract （JCOE） in normal and HIV-infected individuals[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 1997， 51（10）： 427-429
[3] Shiozaki K.， Shiozaki M.， Masuda J.， Yamauchi A.， Ohwada S.， Nakano T.， Yamaguchi T.， Saito T.， Muramoto K.， Sato M. Identification of oyster-derived hypotensive peptide acting as angiotensin-I-converting enzyme inhibitor[J]. Fisheries Science， 2010， 76（5）： 865-872
[4] Anderson R.S.， Beaven A.E. Antibacterial activities of oyster （Crassostrea virginica） and mussel （Myrillus edulis and Geukensia demissa） plasma[J]. Aquatic living resources，2001，14（6）： 343-349
[5] 张金铃， 迟海， 李伟， 等.壳聚糖固定化胰蛋白酶制备魁蚶肽的研究[J].水产科学， 2010， 29（9）： 553-555