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摘要：从原种培育和保存、母本园的建立、病毒检测。检察记载及苗木繁育管理技术等方面，详细介绍了无病毒苗木繁育体系的各个组成部分及详细操作规程，以期规范我国无病毒苗木繁育行为，推进我国苗木繁育产业健康发展。
关键词：苹果；无病毒苗木繁育；规程
据我们多年来对本地果园的调查显示，苹果病毒病发生率相对较轻，一般不超过5％，且99％以上为花叶病毒病。但是近年情况发生了变化，新建园花叶病、锈果病发病率有逐年上升的趋势，去年我县一果农在0.13hm2初结果园，就发现了20多株锈果花脸型病毒病，而我省科研部门2010年的调查结果更为严峻，调查地区花叶病发病率平均达到了30.04％，个别新建园高达70％，调查的一个苗圃花叶病发病率达到了55.8％。针对新建苹果园病毒病发病率普遍提升这一现状，推广无病毒苗木繁育技术，规范育苗行为，提高广大育苗户的育苗水平，就显得尤为重要。
1无病毒苗木繁育体系及各个组成部分的主要功能
无病毒苗木繁育体系是指经国家或省(市、区)主管部门核准，由不同单位组成的完成苹果无病毒苗木生产的各层次、各环节任务的组织整体：包括无病毒原种保存圃、无病毒母本园及无病毒苗木繁殖圃等三部分。
苹果无病毒原种保存圃承担无病毒原种的培育、保存的任务，负责进行主要苹果品种和砧木的脱毒、培育和从国内外引进无病毒原种，向无病毒母本园提供无病毒苹果品种、无性系砧木原种，协助母本园单位建立无病毒品种采穗圃、砧木采种园和无性系砧木压条圃。国家和省无病毒原种保存圃由农业部确认。
无病毒母本园包括无病毒苹果品种采穗圃、无病毒砧木采种园、无病毒无性系砧木压条圃。母本园承担单位由农业部和各省(市、区)主管部门核准认定。母本园的繁殖材料由原种保存单位提供，并接受病毒检测机构的定期病毒检测，一旦发现问题立即更换：母本园承担单位负责向育苗单位供应各种无病毒品种接穗、砧木种子和苗木。
苹果无病毒苗木繁殖圃种子、无性系砧木繁殖材料和接穗，都必须来自无病毒母本园，不允许从苗木上采接穗进行以苗繁苗。苹果无病毒苗木繁育单位负责无病毒实生砧、无性系砧木的繁殖和嫁接栽培品种，向生产单位供应苹果无病毒苗木。苹果无病毒苗木繁育单位由省主管部门核准认定，并颁发苹果无病毒苗木生产许可证，同时还应有上级主管部门根据母本园提供接穗量确定的无病毒苗木准产数量证明。2原种培育和保存
2.1待脱毒材料
凡准备进行脱毒处理的品种和砧木均应是通过国家或省农作物品种审定委员会审定的品种和砧木。选取经3年以上观察未发现过锈果病、绿皱果病和花叶病症状的结果树作为待脱毒材料母本树，从其上采集接穗作为待脱毒材料。
2.2脱毒处理
2.2.1热处理脱毒法 于每年4月中旬，从待脱毒品种植株上剪取接穗，采用切接法嫁接在盆栽实生砧苗上，每品种10～15盆。嫁接成活后，按常规苗在室外进行管理。翌年2月上中旬将待脱毒盆栽苗移入温室，从地面以上20cm剪截留3-5个饱满芽。同时将盆栽砧木移入温室，使其萌动生长。待脱毒苗萌动长出幼叶后，移入恒温热处理箱，将温度控制在28～30℃。3～5d后待盆栽苗长出3～5片新叶时，将温度调至(38土1)℃，进行热处理并开始计时。热处理28d后，从抽发的新梢顶端，切取1.0～1.5cm的嫩梢，采用劈接或皮下嫁接法嫁接在预先准备好的盆栽实生砧木上，用塑料薄膜包扎，并套上白色透明塑料袋保温，放阴凉处，2周后取下塑料袋，约10d后再移入温室内有阳光处，待长出3～5片新叶后移到室外锻炼10～15d，即可移入苗圃，按正常苗进行管理。于6月上旬采取脱毒苗新叶进行血清学检测，淘汰带毒苗。未检测出病毒的脱毒苗于8月中旬采用指示植物鉴定法进行复检，确认无病毒后作为无病毒原种母本树保存。
2.2.2茎尖培养脱毒法 (1)脱毒材料准备。从田间大树上切取2～3cm长的新梢顶尖，用70％酒精浸渍30s，用0.1％升汞灭菌5min，无菌水冲洗3～5遍，在解剖镜下剥离幼叶和叶原基，切取0.1～0.2mm的茎尖，接种到分化培养基上，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照10h／d的条件下培养。每个月换1次培养基，3～4个月后可分化出新芽。(2)增殖培养。培养基、培养条件与初代培养相同，每隔30～40d转接1次。增殖试管苗可采用酶联免疫吸附法进行病毒初检，带毒样品剔除或进行热处理脱毒。(3)诱导生根。从初检不带毒样品上切取长1.5cm的嫩梢插入生根培养基中，在25℃下经15～20d即可长出新根。对生根率较低的品种可适当调整生长调节剂的浓度或加入间苯三酚或增加培养代数。(4)移栽。栽前将组培生根苗置于强光下，闭瓶锻炼2d(加少量水)。以腐殖土、砂或蛭石为基质，洗净根部粘附的培养基后栽到基质中，浇透水，盖上塑料薄膜和报纸保温遮阴，10d后逐渐通风透光，每周浇1次1／4～1／8MS营养液促进生长。初春为移栽适期，温度保持在15～25℃。(5)移入苗圃。将移栽成活的组培苗移到室外炼苗1～2周。圃地开沟打垅，施入基肥，将苗带土移栽，灌足水。(6)病毒检测。8月份从移栽成活苗上剪取带12～15个饱满芽的枝条，按芽系编号，采用指示植物进行鉴定。检测后保存无病毒的芽系，将带病毒的芽系剔除或再次热处理。
2.2.3热处理结合茎尖培养脱毒法
切取热处理过程中长出的新梢顶端0.3～0.5mm的茎尖进行组织培养。先进行微茎尖组织培养，分化成丛状苗。经过继代扩繁后，先在(25±3)℃的培养室内培养4～5d，再在(38±1)℃的光照培养箱中培养4～6周后，切取3mm左右的茎尖进行培养。(3)对分化的每个芽丛分别编号，经培养成苗，准备病毒检测。
2.3脱毒材料的病毒检测
经脱毒处理获得的材料先通过血清学方法进行检测，显阳性反应的剔除，显阴性反应的再采用木本指示植物法进行检测。
2.4无病毒原种的保存
2.4.1保存方式 苹果品种和砧木，经过脱毒处理和病毒检测后，确认无病毒后即可作为无病毒原种，保存在培育原种的单位，保存的方式有田间原种保存圃保存和室内组培保存，有条件的建立基因库保存。(1)田间原种保存圃保存。无病毒原种树最好盆栽于有防虫保护网设备的网室内或专门的温室里，并远离有病毒潜伏来源的果园2km以上。(2)组培保存。由组织培养方法获得的无病毒原种可以保留在瓶内继代培养。如果需用接穗，可以扩繁几代，移至田间。 2.4.2病毒检测 无病毒原种树每5年应进行1次病毒检测，发现问题即剔除。检测机构要将病毒检测结果报告主管部门。
30生产单位母本园的建立、病毒检测及档案记载
3.1苹果无病毒母本园的建立
园地应选择未曾栽植过果树的地段，且与一般果树或苗木相距50m以上，与普通仁果类、核果类果园和苗圃距离应大于100m(GB／T12943-2007)。建园前按无病毒苹果品种采穗圃、砧木采种园和无性系砧木压条圃进行区划。设计好排灌系统、道路、建筑物等，并进行土地平整和土壤改良。母本树的栽植技术与一般生产园相同。
无病毒苹果品种采穗圃：母本树由无病毒原种保存圃提供，明确记载品种，引进品种外文名称、品系、株系、砧木、原母株株系、引进单位、来源、时间、脱毒、病毒检测的单位、时间。按品种、株系成行栽植，行距4～5m，株距3～4m。同一株系按顺序编号，栽植在一起，定植后绘制采穗圃各品种、品系、株系分布图，并做好标记，不得混杂。要加强肥水管理，保证树势健壮，每年产生一定数量充实的接穗，同时亦要求正常结果，以观察果实的园艺性状。
苹果无病毒砧木采种园：砧木种类按各苹果产区适用的砧木确定。所用种子必须从无病毒母株上采集。
苹果无病毒无性系砧木压条圃：母本树来源于无病毒原种保存圃，栽植母本树之前应进行土壤消毒，防止线虫和根癌病危害。并要每年平茬，保持从基部萌生枝条的能力。无性系砧木繁殖方法有垂直压条和水平压条等，其方法与普通砧木苗相同。无病毒无性系砧木压条圃只提供无性砧木自根苗和用作中间砧的接穗，不允许在压条圃嫁接。
3.2苹果无病毒母本园的病毒检测
凡发现母本树有显性病毒症状，应立即拨除消毒。每5年随机抽样进行潜隐性病毒检测1次，一旦发现病毒症状，应立即淘汰。母本树登记1次有效期为5年。
3.3建立苹果无病毒母本园的技术档案
每年记载各品种、株系的生长量，(干周、树高、枝展、新梢生长量)、始花、始果年龄、产量、果实大小、色泽等，逐年记载，不得间断和遗漏。记录母本园向外提供的’苹果品种接穗、无性系砧木苗、砧木种子、种类、品种(或类型)、数量和接收单位。
4苗木繁育
4.1苗圃的建立
选择的苗圃地应地势平坦，有灌溉条件，土壤肥沃，有机质含量丰富，酸碱度适中，距一般苹果、梨园或一般生产性苗圃50m以上，5年没有种植过苹果树、梨树或繁育过苹果苗、梨苗，交通方便的地方。
4.2苗圃规划和建设
苗圃规划应从便于管理的角度出发，划分为若干小区。规划出实生苗播种区、无性系砧木繁殖区、成苗培养区以及休闲区等。并按规划设计出各级道路、排灌系统，并统筹安排，平整土地，改良土壤，以及增施有机肥。
4.3实生砧木培育
砧木种子必须采自无病毒砧木采种园或经病毒检测确认无病毒的种子。秋季或早春播种。播前每667m2施有机肥2500～3000kg、磷肥100kg，深翻土地，平整作畦，施用杀菌剂和杀虫剂，进行土壤消毒。播种方法和田间管理与一般生产性苗圃相同。
4.4无性系砧木培育
无性系砧木繁殖材料，必须来自无病毒母本园。繁殖方法：(1)直接从无病毒母本园引进无性系砧木自根苗，经过一年集中培育，秋季嫁接栽培品种；(2)从无病毒母本园采集无性系砧木种条，嫁接在无病毒的实生砧木上，准备培养中间砧木，然后再嫁接无毒品种接穗；(3)用组织培养方法快速繁殖无病毒无性系砧木。
4.5嫁接苗的管理
4.5.1接穗的采集 接穗必须从无病毒苹果品种采穗圃采集，剪下的接穗立即剪去叶片，按株分扎成捆，并登记母本树的品种(品系)名称及采集时间。
4.5.2嫁接 秋季采用芽接法，春季采用枝接法，接后要按品种、品系分别记载。补接时，必须保证与原来嫁接的母株相同，否则不予补接。
(收稿日期：2011-12-14)
关键词：苹果；无病毒苗木繁育；规程
据我们多年来对本地果园的调查显示，苹果病毒病发生率相对较轻，一般不超过5％，且99％以上为花叶病毒病。但是近年情况发生了变化，新建园花叶病、锈果病发病率有逐年上升的趋势，去年我县一果农在0.13hm2初结果园，就发现了20多株锈果花脸型病毒病，而我省科研部门2010年的调查结果更为严峻，调查地区花叶病发病率平均达到了30.04％，个别新建园高达70％，调查的一个苗圃花叶病发病率达到了55.8％。针对新建苹果园病毒病发病率普遍提升这一现状，推广无病毒苗木繁育技术，规范育苗行为，提高广大育苗户的育苗水平，就显得尤为重要。
1无病毒苗木繁育体系及各个组成部分的主要功能
无病毒苗木繁育体系是指经国家或省(市、区)主管部门核准，由不同单位组成的完成苹果无病毒苗木生产的各层次、各环节任务的组织整体：包括无病毒原种保存圃、无病毒母本园及无病毒苗木繁殖圃等三部分。
苹果无病毒原种保存圃承担无病毒原种的培育、保存的任务，负责进行主要苹果品种和砧木的脱毒、培育和从国内外引进无病毒原种，向无病毒母本园提供无病毒苹果品种、无性系砧木原种，协助母本园单位建立无病毒品种采穗圃、砧木采种园和无性系砧木压条圃。国家和省无病毒原种保存圃由农业部确认。
无病毒母本园包括无病毒苹果品种采穗圃、无病毒砧木采种园、无病毒无性系砧木压条圃。母本园承担单位由农业部和各省(市、区)主管部门核准认定。母本园的繁殖材料由原种保存单位提供，并接受病毒检测机构的定期病毒检测，一旦发现问题立即更换：母本园承担单位负责向育苗单位供应各种无病毒品种接穗、砧木种子和苗木。
苹果无病毒苗木繁殖圃种子、无性系砧木繁殖材料和接穗，都必须来自无病毒母本园，不允许从苗木上采接穗进行以苗繁苗。苹果无病毒苗木繁育单位负责无病毒实生砧、无性系砧木的繁殖和嫁接栽培品种，向生产单位供应苹果无病毒苗木。苹果无病毒苗木繁育单位由省主管部门核准认定，并颁发苹果无病毒苗木生产许可证，同时还应有上级主管部门根据母本园提供接穗量确定的无病毒苗木准产数量证明。2原种培育和保存
2.1待脱毒材料
凡准备进行脱毒处理的品种和砧木均应是通过国家或省农作物品种审定委员会审定的品种和砧木。选取经3年以上观察未发现过锈果病、绿皱果病和花叶病症状的结果树作为待脱毒材料母本树，从其上采集接穗作为待脱毒材料。
2.2脱毒处理
2.2.1热处理脱毒法 于每年4月中旬，从待脱毒品种植株上剪取接穗，采用切接法嫁接在盆栽实生砧苗上，每品种10～15盆。嫁接成活后，按常规苗在室外进行管理。翌年2月上中旬将待脱毒盆栽苗移入温室，从地面以上20cm剪截留3-5个饱满芽。同时将盆栽砧木移入温室，使其萌动生长。待脱毒苗萌动长出幼叶后，移入恒温热处理箱，将温度控制在28～30℃。3～5d后待盆栽苗长出3～5片新叶时，将温度调至(38土1)℃，进行热处理并开始计时。热处理28d后，从抽发的新梢顶端，切取1.0～1.5cm的嫩梢，采用劈接或皮下嫁接法嫁接在预先准备好的盆栽实生砧木上，用塑料薄膜包扎，并套上白色透明塑料袋保温，放阴凉处，2周后取下塑料袋，约10d后再移入温室内有阳光处，待长出3～5片新叶后移到室外锻炼10～15d，即可移入苗圃，按正常苗进行管理。于6月上旬采取脱毒苗新叶进行血清学检测，淘汰带毒苗。未检测出病毒的脱毒苗于8月中旬采用指示植物鉴定法进行复检，确认无病毒后作为无病毒原种母本树保存。
2.2.2茎尖培养脱毒法 (1)脱毒材料准备。从田间大树上切取2～3cm长的新梢顶尖，用70％酒精浸渍30s，用0.1％升汞灭菌5min，无菌水冲洗3～5遍，在解剖镜下剥离幼叶和叶原基，切取0.1～0.2mm的茎尖，接种到分化培养基上，在(25±2)℃、光照度1500～2000lx、光照10h／d的条件下培养。每个月换1次培养基，3～4个月后可分化出新芽。(2)增殖培养。培养基、培养条件与初代培养相同，每隔30～40d转接1次。增殖试管苗可采用酶联免疫吸附法进行病毒初检，带毒样品剔除或进行热处理脱毒。(3)诱导生根。从初检不带毒样品上切取长1.5cm的嫩梢插入生根培养基中，在25℃下经15～20d即可长出新根。对生根率较低的品种可适当调整生长调节剂的浓度或加入间苯三酚或增加培养代数。(4)移栽。栽前将组培生根苗置于强光下，闭瓶锻炼2d(加少量水)。以腐殖土、砂或蛭石为基质，洗净根部粘附的培养基后栽到基质中，浇透水，盖上塑料薄膜和报纸保温遮阴，10d后逐渐通风透光，每周浇1次1／4～1／8MS营养液促进生长。初春为移栽适期，温度保持在15～25℃。(5)移入苗圃。将移栽成活的组培苗移到室外炼苗1～2周。圃地开沟打垅，施入基肥，将苗带土移栽，灌足水。(6)病毒检测。8月份从移栽成活苗上剪取带12～15个饱满芽的枝条，按芽系编号，采用指示植物进行鉴定。检测后保存无病毒的芽系，将带病毒的芽系剔除或再次热处理。
2.2.3热处理结合茎尖培养脱毒法
切取热处理过程中长出的新梢顶端0.3～0.5mm的茎尖进行组织培养。先进行微茎尖组织培养，分化成丛状苗。经过继代扩繁后，先在(25±3)℃的培养室内培养4～5d，再在(38±1)℃的光照培养箱中培养4～6周后，切取3mm左右的茎尖进行培养。(3)对分化的每个芽丛分别编号，经培养成苗，准备病毒检测。
2.3脱毒材料的病毒检测
经脱毒处理获得的材料先通过血清学方法进行检测，显阳性反应的剔除，显阴性反应的再采用木本指示植物法进行检测。
2.4无病毒原种的保存
2.4.1保存方式 苹果品种和砧木，经过脱毒处理和病毒检测后，确认无病毒后即可作为无病毒原种，保存在培育原种的单位，保存的方式有田间原种保存圃保存和室内组培保存，有条件的建立基因库保存。(1)田间原种保存圃保存。无病毒原种树最好盆栽于有防虫保护网设备的网室内或专门的温室里，并远离有病毒潜伏来源的果园2km以上。(2)组培保存。由组织培养方法获得的无病毒原种可以保留在瓶内继代培养。如果需用接穗，可以扩繁几代，移至田间。 2.4.2病毒检测 无病毒原种树每5年应进行1次病毒检测，发现问题即剔除。检测机构要将病毒检测结果报告主管部门。
30生产单位母本园的建立、病毒检测及档案记载
3.1苹果无病毒母本园的建立
园地应选择未曾栽植过果树的地段，且与一般果树或苗木相距50m以上，与普通仁果类、核果类果园和苗圃距离应大于100m(GB／T12943-2007)。建园前按无病毒苹果品种采穗圃、砧木采种园和无性系砧木压条圃进行区划。设计好排灌系统、道路、建筑物等，并进行土地平整和土壤改良。母本树的栽植技术与一般生产园相同。
无病毒苹果品种采穗圃：母本树由无病毒原种保存圃提供，明确记载品种，引进品种外文名称、品系、株系、砧木、原母株株系、引进单位、来源、时间、脱毒、病毒检测的单位、时间。按品种、株系成行栽植，行距4～5m，株距3～4m。同一株系按顺序编号，栽植在一起，定植后绘制采穗圃各品种、品系、株系分布图，并做好标记，不得混杂。要加强肥水管理，保证树势健壮，每年产生一定数量充实的接穗，同时亦要求正常结果，以观察果实的园艺性状。
苹果无病毒砧木采种园：砧木种类按各苹果产区适用的砧木确定。所用种子必须从无病毒母株上采集。
苹果无病毒无性系砧木压条圃：母本树来源于无病毒原种保存圃，栽植母本树之前应进行土壤消毒，防止线虫和根癌病危害。并要每年平茬，保持从基部萌生枝条的能力。无性系砧木繁殖方法有垂直压条和水平压条等，其方法与普通砧木苗相同。无病毒无性系砧木压条圃只提供无性砧木自根苗和用作中间砧的接穗，不允许在压条圃嫁接。
3.2苹果无病毒母本园的病毒检测
凡发现母本树有显性病毒症状，应立即拨除消毒。每5年随机抽样进行潜隐性病毒检测1次，一旦发现病毒症状，应立即淘汰。母本树登记1次有效期为5年。
3.3建立苹果无病毒母本园的技术档案
每年记载各品种、株系的生长量，(干周、树高、枝展、新梢生长量)、始花、始果年龄、产量、果实大小、色泽等，逐年记载，不得间断和遗漏。记录母本园向外提供的’苹果品种接穗、无性系砧木苗、砧木种子、种类、品种(或类型)、数量和接收单位。
4苗木繁育
4.1苗圃的建立
选择的苗圃地应地势平坦，有灌溉条件，土壤肥沃，有机质含量丰富，酸碱度适中，距一般苹果、梨园或一般生产性苗圃50m以上，5年没有种植过苹果树、梨树或繁育过苹果苗、梨苗，交通方便的地方。
4.2苗圃规划和建设
苗圃规划应从便于管理的角度出发，划分为若干小区。规划出实生苗播种区、无性系砧木繁殖区、成苗培养区以及休闲区等。并按规划设计出各级道路、排灌系统，并统筹安排，平整土地，改良土壤，以及增施有机肥。
4.3实生砧木培育
砧木种子必须采自无病毒砧木采种园或经病毒检测确认无病毒的种子。秋季或早春播种。播前每667m2施有机肥2500～3000kg、磷肥100kg，深翻土地，平整作畦，施用杀菌剂和杀虫剂，进行土壤消毒。播种方法和田间管理与一般生产性苗圃相同。
4.4无性系砧木培育
无性系砧木繁殖材料，必须来自无病毒母本园。繁殖方法：(1)直接从无病毒母本园引进无性系砧木自根苗，经过一年集中培育，秋季嫁接栽培品种；(2)从无病毒母本园采集无性系砧木种条，嫁接在无病毒的实生砧木上，准备培养中间砧木，然后再嫁接无毒品种接穗；(3)用组织培养方法快速繁殖无病毒无性系砧木。
4.5嫁接苗的管理
4.5.1接穗的采集 接穗必须从无病毒苹果品种采穗圃采集，剪下的接穗立即剪去叶片，按株分扎成捆，并登记母本树的品种(品系)名称及采集时间。
4.5.2嫁接 秋季采用芽接法，春季采用枝接法，接后要按品种、品系分别记载。补接时，必须保证与原来嫁接的母株相同，否则不予补接。
(收稿日期：2011-12-14)