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摘要[目的]研究氨氮和亚硝酸氮对偏顶蛤的急性毒性，为合理调控偏顶蛤水体中氨氮与亚硝酸氮提供参考价值。[方法]采用常规生物毒性试验方法，研究偏顶蛤对氨氮和亚硝酸氮毒性的耐受力。[结果]氨氮对偏顶蛤的半致死浓度96 h LC50为158.85 mg/L，安全浓度（SC）为15.89 mg/L；非离子氨对偏顶蛤半致死浓度96 h LC50为14.06 mg/L，安全浓度（SC）为1.41 mg/L。亚硝酸氮对试验蛤的半致死浓度96 h LC50为54.20 mg/L，安全浓度（SC）为5.42 mg/L。[结论]与亚硝酸盐相比，偏顶蛤对总氨氮毒性的耐受力更强，非离子氨对偏顶蛤的毒性最强。
关键词偏顶蛤；非离子氨；亚硝酸氮；耐受力
中图分类号S912文献标识码A文章编号0517-6611（2016）08-115-03
Abstract[Objective] To research the acute toxicity of ammonia nitrogen and nitrite to Modiolus modiolus， and to provide references for the rational adjustment of ammonia nitrogen and nitrite nitrogen in M. modiolus. [Method] Conventional biological toxicity test was used to research the tolerance of M. modiolus to ammonia nitrogen and nitrite.[Result] The 96 h LC50 of total ammonia nitrogen， nonionic ammonia nitrogen and nitrite nitrogen to M. modiolus were 158.85， 14.06 and 54.20 mg/L， respectively. And the safe concentrations （SC） of total ammonia nitrogen， nonionic ammonia nitrogen and nitrite nitrogen to the mussels were 15.89， 1.41 and 5.42 mg/L， respectively. [Conclusion] M. modiolus has stronger tolerance to total ammonia nitrogen toxicity than nitrite nitrogen， and the high toxicity occurs in nonionic ammonia nitrogen.
Key wordsModiolus modiolus； Nonionic ammonia nitrogen； Nitrite nitrogen； Tolerance
偏顶蛤（Modiolus modiolus Linnaéus）俗称毛海红，隶属软体动物门瓣鳃纲贻贝目贻贝科偏顶蛤属。20世纪80年代偏顶蛤在我国黄海、渤海资源十分丰富，自潮间带下区到水深50 m的浅海均有分布。偏顶蛤个体大、肉质鲜美、高蛋白、低脂肪，具有较高的市场价值和开发潜力[1-2]。
近年来，我国海产贝类增养殖业快速发展，但对其自然资源缺乏系统管理和保护，加上海域污染、种质退化日趋严重，偏顶蛤、厚壳贻贝（Mytilus coruscus）、翡翠贻贝（Perna viridis）的自然储存量已大幅度减少[2-3]。贝类人工繁育与室内工厂化养殖是解决其资源匮乏的主要措施，而养殖水体是制约贝类生产实践的重要因素[4-5]。研究表明，氨氮与亚硝酸氮是养殖水环境中制约水产动物生长和发育的主要因子之一，当其浓度超标时，不仅会对养殖动物产生直接毒害，而且能诱发多种疾病[6]。尤其在高密度养殖过程中，大量残饵、排泄物和尸体等含氮有机物经过微生物分解产生氨氮、亚硝酸氮等有毒物质，且随着养殖时间的增加不断积累。因此，氨氮和亚硝酸氮在海产贝类集约化养殖过程中普遍存在，并限制着贝类增养殖业的进一步发展[7]。笔者以成体偏顶蛤为研究对象，研究了氨氮和亚硝酸氮对偏顶蛤的急性毒性效应，旨在为其养殖业的健康稳定发展提供理论参考。
1材料与方法
1.1试验材料
试验用偏顶蛤采自大连黑石礁海域，壳长（81.32 ± 6.20）mm，壳高（45.97 ±3.87）mm，壳宽（39.27 ± 3.02）mm，湿质量（93.79 ± 8.13）g，运回实验室暂养。暂养期间投喂金藻，辅以螺旋藻，早晚各投喂1次/d，投饵前换水1/2。暂养7 d后进行毒性试验，试验前24 h停止投喂，试验期间不投饵。海水经过3级沙滤，温度19～20 ℃，盐度31.20%，pH为8.20。
试剂所用分析纯NH4Cl和NaNO2（药品均由天津市大茂化学试剂厂生产，相对分子量分别为53.49和69.00），烘干至恒重，用海水溶解后配制成20 g/L的母液，避光冷藏保存，备用。
1.2试验方法
预试验初步确定试验蛤对氨氮和亚硝酸氮的耐受能力。根据预试验结果，用移液管吸取一定量配制的母液，总氨浓度分别为67.29、84.45、106.32、134.58、168.22、212.30、267.48 mg/L；亚硝酸氮浓度分别设为23.67、42.67、75.00、133.33、236.67、420.67 mg/L。每个浓度组设置3个平行，每个平行14只偏顶蛤，同时设置3组不添加NH4Cl和NaNO2的空白对照组，每组14只偏顶蛤。试验用50 L蓝色聚乙烯塑料水槽为容器，每个水槽注入上述配制的试验液40 L。 试验期间不投喂、不充气，以保证NH4Cl和NaNO2浓度相对稳定，每24 h全部更换试验液1次。每天观察偏顶蛤的中毒症状、活动和死亡情况，记录24、48、72、96 h的死亡数。偏顶蛤贝壳大开，刺激不能闭合，放入正常海水中5 h不能闭合，则判定为死亡。
1.3数据处理
试验数据使用SPSS 17.0统计软件进行统计与分析，采用直线内插法计算96 h半数致死浓度和95%置信区间。使用以下公式计算96 h半致死浓度及安全浓度[8]：
LC50 =C1+（P1-50%）×（C2-C1）/（P1-P2）（1）
SC=0.1×96 h LC50 （2）
式中，C1和C2分别表示成活率最接近50%的低浓度和高浓度，P1和P2分别表示C1和C2浓度对应的成活率。
按照以下公式计算非离子态氮浓度：
CNH3-Nm=CNH3-Nt/[10（pKa-pH）+ 1]（3）
式中，pKa= 0.090 18 +2 729.92/T，pKa为NH4N表观电离常数的负对数，T为开氏温度，T= 273 +t（℃），t为试验时海水温度；CNH3-Nm和CNH3-Nt分别表示非离子氨和总氨氮浓度。水体中总氨氮浓度与非离子浓度的对应关系如表1所示。
2结果与分析
2.1氨氮对偏顶蛤的急性毒性
根据试验结果绘制氨氮浓度对数值与死亡率的关系曲线（图1）。从图1和表2可以看出，在海水温度19～20 ℃、盐度31.20‰、pH 8.20的条件下，不同氨氮浓度下偏顶蛤72 h死亡率均较低，低于20%。96 h，试验蛤死亡率随氨氮浓度的升高而增加，总氨氮浓度267.48 mg/L的处理组偏顶蛤全部死亡。偏顶蛤对总氨和非离子氨的96 h半致死浓度分别为158.85和14.06 mg/L，相应的安全浓度分别为15.89和1.41 mg/L。
2.2亚硝酸氮对偏顶蛤的急性毒性
根据测定的不同亚硝酸盐浓度下偏顶蛤的死亡率，绘制浓度对数值与死亡率的关
系曲线（图2）。从图2和表3可以看出，不同浓度亚硝酸氮
对偏顶蛤的毒性效果明显。相同时间内，亚硝酸氮浓度越
高，毒性越强，试验蛤的死亡率就越高；不同浓度亚硝酸氮处理组试验蛤死亡率随胁迫时间的延长而增加。偏顶蛤对亚
硝酸氮的96 h半致死浓度为54.20 mg/L，相应的安全浓度为5.42 mg/L。
3讨论与结论
3.1氨氮与亚硝酸氮的来源及对偏顶蛤致死机理
相关研究表明，海产贝类氨排泄量占总排泄量的70%左右[9]。自然条件下，偏顶蛤常附着在低潮下区礁石和海底砾石上，喜群聚生活[10]。因此，偏顶蛤人工增养殖过程中大量残饵、排泄物易堆积；加之养殖水环境定期使用消毒药物，杀灭病原微生物的同时，有益微生物随之消失或减少，大量积累的氨氮硝化过程受抑制，导致养殖水体中氨氮和亚硝酸氮等有害物质含量增加[6]。自然水体中亚硝酸氮浓度较低，对海产贝类的毒害作用较小，但在高密度集约化养殖过程中氨氮积累、硝化细菌活力降低和硝化作用失衡都可能引起亚硝酸氮浓度升高[11]。
氨氮在水体中以离子氨和非离子氨2种形式存在，二者可相互转化，当pH小于7时主要以离子氨形式存在，毒性小；当pH大于7时，大多以分子氨形式存在；当pH大于11时，几乎以分子氨形式存在。分子氨有较强的脂溶性，易穿透脂质性细胞膜，改变贝类体内渗透压，破坏鳃组织；分子氨进入血液，抑制血液载氧能力，严重时可引起偏顶蛤窒息甚至死亡[10，12]。
亚硝酸氮可降低体内抗氧化酶（如酚氧化酶、溶菌酶）的活力，降低水产动物的免疫力，诱发多种疾病[13]。亚硝酸氮进入血液，可将血红蛋白分子的亚铁离子氧化为三价铁离子，破坏载氧蛋白结构和功能，降低其载氧能力，造成组织缺氧、代谢紊乱、神经麻痹甚至死亡[13-15]。养殖水体中亚硝酸氮进入虾类血液，可将氧合血蓝蛋白转化为脱氧血蓝蛋白，降低血淋巴运氧能力，从而使贝类机体缺氧甚至致死[16]。
3.2偏顶蛤对氨氮和亚硝酸氮的耐受能力
3.2.1中毒症状。
该试验结果表明，高浓度组氨氮和亚硝酸氮对偏顶蛤均具有较强的毒害作用，其中毒症状相似。24 h内绝大多数偏顶蛤可正常开闭壳，受刺激时闭壳迅速，足伸出活动；24 h后试验蛤多数闭壳，少数开壳刺激缓慢闭合。偏顶蛤贝壳大、闭壳肌强大有力，主动闭壳机制增强其对毒性的耐受力，这与泥蚶（Tegillarca granosa）能耐受较高浓度氨氮毒性的机理一致[17]。随着攻毒时间的延长，偏顶蛤贝壳张开，反应迟钝；足无力伸长，刺激收缩慢或不收缩；内脏团开始脱水萎缩，外套膜和鳃丝开始腐烂；出现雌雄产卵排精现象，精卵排放后不扩散。氨氮低浓度组，偏顶蛤短时间内（24 h）不出现中毒症状，随着胁迫时间的延长而逐渐表现出中毒症状；低浓度亚硝酸氮组偏顶蛤中毒症状较早出现。
3.2.2毒性比较。
该试验结果表明，偏顶蛤对总氨的96 h半致死浓度是亚硝酸氮的2.95倍，而偏顶蛤对亚硝酸氮96 h半致死浓度是非离子氨的3.83倍，表明非离子氨对偏顶蛤的毒性远大于亚硝酸氮的毒性，因此非离子氨毒性在偏顶蛤增养殖过程中应着重考虑。王娟等[18]研究亚硝酸盐和氨氮对中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）急性毒性效应得出了相似的结论。与氨氮毒性相比，偏顶蛤对低浓度亚硝酸氮毒性更为敏感，据此推测这可能与偏顶蛤生存水体中高氨氮低亚硝酸氮有关。
3.3氨氮和亚硝酸氮的防控措施
养殖水体中氨氮和亚硝酸氮对生物有机体的毒性受多种因子的影响，如pH、温度、盐度、溶解氧、受试动物规格和生理状态[19-24]。相关研究表明，盐度越低，氨氮和亚硝酸氮毒性越强[20-21，23]，适当增加盐度有助于缓解养殖水体中氨氮和亚硝酸氮的毒性。海水pH对氨氮毒性的影响显著，pH越高，氨氮毒性越强。相关研究表明，pH升高1.0，则氨氮毒性增强近10倍[20]；海水中亚硝酸氮的毒性随pH的升高而降低[22]。因此，维持养殖水环境中适宜pH十分关键，高密度养殖水产动物时应做到长期监测，定期调整。同时，适当增加溶解氧可以有效降低水体中氨氮和亚硝酸氮的毒性[24]。因此，水产动物养殖过程中应保证养殖水体充足的曝气时间，维持较高的溶氧量。此外，控制水产动物放养密度，以减少自身污染，使用生态制剂来改良水质，定期倒池、清塘消毒等均可以有效降低养殖水环境中氨氮和亚硝酸氮的毒性。 参考文献
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关键词偏顶蛤；非离子氨；亚硝酸氮；耐受力
中图分类号S912文献标识码A文章编号0517-6611（2016）08-115-03
Abstract[Objective] To research the acute toxicity of ammonia nitrogen and nitrite to Modiolus modiolus， and to provide references for the rational adjustment of ammonia nitrogen and nitrite nitrogen in M. modiolus. [Method] Conventional biological toxicity test was used to research the tolerance of M. modiolus to ammonia nitrogen and nitrite.[Result] The 96 h LC50 of total ammonia nitrogen， nonionic ammonia nitrogen and nitrite nitrogen to M. modiolus were 158.85， 14.06 and 54.20 mg/L， respectively. And the safe concentrations （SC） of total ammonia nitrogen， nonionic ammonia nitrogen and nitrite nitrogen to the mussels were 15.89， 1.41 and 5.42 mg/L， respectively. [Conclusion] M. modiolus has stronger tolerance to total ammonia nitrogen toxicity than nitrite nitrogen， and the high toxicity occurs in nonionic ammonia nitrogen.
Key wordsModiolus modiolus； Nonionic ammonia nitrogen； Nitrite nitrogen； Tolerance
偏顶蛤（Modiolus modiolus Linnaéus）俗称毛海红，隶属软体动物门瓣鳃纲贻贝目贻贝科偏顶蛤属。20世纪80年代偏顶蛤在我国黄海、渤海资源十分丰富，自潮间带下区到水深50 m的浅海均有分布。偏顶蛤个体大、肉质鲜美、高蛋白、低脂肪，具有较高的市场价值和开发潜力[1-2]。
近年来，我国海产贝类增养殖业快速发展，但对其自然资源缺乏系统管理和保护，加上海域污染、种质退化日趋严重，偏顶蛤、厚壳贻贝（Mytilus coruscus）、翡翠贻贝（Perna viridis）的自然储存量已大幅度减少[2-3]。贝类人工繁育与室内工厂化养殖是解决其资源匮乏的主要措施，而养殖水体是制约贝类生产实践的重要因素[4-5]。研究表明，氨氮与亚硝酸氮是养殖水环境中制约水产动物生长和发育的主要因子之一，当其浓度超标时，不仅会对养殖动物产生直接毒害，而且能诱发多种疾病[6]。尤其在高密度养殖过程中，大量残饵、排泄物和尸体等含氮有机物经过微生物分解产生氨氮、亚硝酸氮等有毒物质，且随着养殖时间的增加不断积累。因此，氨氮和亚硝酸氮在海产贝类集约化养殖过程中普遍存在，并限制着贝类增养殖业的进一步发展[7]。笔者以成体偏顶蛤为研究对象，研究了氨氮和亚硝酸氮对偏顶蛤的急性毒性效应，旨在为其养殖业的健康稳定发展提供理论参考。
1材料与方法
1.1试验材料
试验用偏顶蛤采自大连黑石礁海域，壳长（81.32 ± 6.20）mm，壳高（45.97 ±3.87）mm，壳宽（39.27 ± 3.02）mm，湿质量（93.79 ± 8.13）g，运回实验室暂养。暂养期间投喂金藻，辅以螺旋藻，早晚各投喂1次/d，投饵前换水1/2。暂养7 d后进行毒性试验，试验前24 h停止投喂，试验期间不投饵。海水经过3级沙滤，温度19～20 ℃，盐度31.20%，pH为8.20。
试剂所用分析纯NH4Cl和NaNO2（药品均由天津市大茂化学试剂厂生产，相对分子量分别为53.49和69.00），烘干至恒重，用海水溶解后配制成20 g/L的母液，避光冷藏保存，备用。
1.2试验方法
预试验初步确定试验蛤对氨氮和亚硝酸氮的耐受能力。根据预试验结果，用移液管吸取一定量配制的母液，总氨浓度分别为67.29、84.45、106.32、134.58、168.22、212.30、267.48 mg/L；亚硝酸氮浓度分别设为23.67、42.67、75.00、133.33、236.67、420.67 mg/L。每个浓度组设置3个平行，每个平行14只偏顶蛤，同时设置3组不添加NH4Cl和NaNO2的空白对照组，每组14只偏顶蛤。试验用50 L蓝色聚乙烯塑料水槽为容器，每个水槽注入上述配制的试验液40 L。 试验期间不投喂、不充气，以保证NH4Cl和NaNO2浓度相对稳定，每24 h全部更换试验液1次。每天观察偏顶蛤的中毒症状、活动和死亡情况，记录24、48、72、96 h的死亡数。偏顶蛤贝壳大开，刺激不能闭合，放入正常海水中5 h不能闭合，则判定为死亡。
1.3数据处理
试验数据使用SPSS 17.0统计软件进行统计与分析，采用直线内插法计算96 h半数致死浓度和95%置信区间。使用以下公式计算96 h半致死浓度及安全浓度[8]：
LC50 =C1+（P1-50%）×（C2-C1）/（P1-P2）（1）
SC=0.1×96 h LC50 （2）
式中，C1和C2分别表示成活率最接近50%的低浓度和高浓度，P1和P2分别表示C1和C2浓度对应的成活率。
按照以下公式计算非离子态氮浓度：
CNH3-Nm=CNH3-Nt/[10（pKa-pH）+ 1]（3）
式中，pKa= 0.090 18 +2 729.92/T，pKa为NH4N表观电离常数的负对数，T为开氏温度，T= 273 +t（℃），t为试验时海水温度；CNH3-Nm和CNH3-Nt分别表示非离子氨和总氨氮浓度。水体中总氨氮浓度与非离子浓度的对应关系如表1所示。
2结果与分析
2.1氨氮对偏顶蛤的急性毒性
根据试验结果绘制氨氮浓度对数值与死亡率的关系曲线（图1）。从图1和表2可以看出，在海水温度19～20 ℃、盐度31.20‰、pH 8.20的条件下，不同氨氮浓度下偏顶蛤72 h死亡率均较低，低于20%。96 h，试验蛤死亡率随氨氮浓度的升高而增加，总氨氮浓度267.48 mg/L的处理组偏顶蛤全部死亡。偏顶蛤对总氨和非离子氨的96 h半致死浓度分别为158.85和14.06 mg/L，相应的安全浓度分别为15.89和1.41 mg/L。
2.2亚硝酸氮对偏顶蛤的急性毒性
根据测定的不同亚硝酸盐浓度下偏顶蛤的死亡率，绘制浓度对数值与死亡率的关
系曲线（图2）。从图2和表3可以看出，不同浓度亚硝酸氮
对偏顶蛤的毒性效果明显。相同时间内，亚硝酸氮浓度越
高，毒性越强，试验蛤的死亡率就越高；不同浓度亚硝酸氮处理组试验蛤死亡率随胁迫时间的延长而增加。偏顶蛤对亚
硝酸氮的96 h半致死浓度为54.20 mg/L，相应的安全浓度为5.42 mg/L。
3讨论与结论
3.1氨氮与亚硝酸氮的来源及对偏顶蛤致死机理
相关研究表明，海产贝类氨排泄量占总排泄量的70%左右[9]。自然条件下，偏顶蛤常附着在低潮下区礁石和海底砾石上，喜群聚生活[10]。因此，偏顶蛤人工增养殖过程中大量残饵、排泄物易堆积；加之养殖水环境定期使用消毒药物，杀灭病原微生物的同时，有益微生物随之消失或减少，大量积累的氨氮硝化过程受抑制，导致养殖水体中氨氮和亚硝酸氮等有害物质含量增加[6]。自然水体中亚硝酸氮浓度较低，对海产贝类的毒害作用较小，但在高密度集约化养殖过程中氨氮积累、硝化细菌活力降低和硝化作用失衡都可能引起亚硝酸氮浓度升高[11]。
氨氮在水体中以离子氨和非离子氨2种形式存在，二者可相互转化，当pH小于7时主要以离子氨形式存在，毒性小；当pH大于7时，大多以分子氨形式存在；当pH大于11时，几乎以分子氨形式存在。分子氨有较强的脂溶性，易穿透脂质性细胞膜，改变贝类体内渗透压，破坏鳃组织；分子氨进入血液，抑制血液载氧能力，严重时可引起偏顶蛤窒息甚至死亡[10，12]。
亚硝酸氮可降低体内抗氧化酶（如酚氧化酶、溶菌酶）的活力，降低水产动物的免疫力，诱发多种疾病[13]。亚硝酸氮进入血液，可将血红蛋白分子的亚铁离子氧化为三价铁离子，破坏载氧蛋白结构和功能，降低其载氧能力，造成组织缺氧、代谢紊乱、神经麻痹甚至死亡[13-15]。养殖水体中亚硝酸氮进入虾类血液，可将氧合血蓝蛋白转化为脱氧血蓝蛋白，降低血淋巴运氧能力，从而使贝类机体缺氧甚至致死[16]。
3.2偏顶蛤对氨氮和亚硝酸氮的耐受能力
3.2.1中毒症状。
该试验结果表明，高浓度组氨氮和亚硝酸氮对偏顶蛤均具有较强的毒害作用，其中毒症状相似。24 h内绝大多数偏顶蛤可正常开闭壳，受刺激时闭壳迅速，足伸出活动；24 h后试验蛤多数闭壳，少数开壳刺激缓慢闭合。偏顶蛤贝壳大、闭壳肌强大有力，主动闭壳机制增强其对毒性的耐受力，这与泥蚶（Tegillarca granosa）能耐受较高浓度氨氮毒性的机理一致[17]。随着攻毒时间的延长，偏顶蛤贝壳张开，反应迟钝；足无力伸长，刺激收缩慢或不收缩；内脏团开始脱水萎缩，外套膜和鳃丝开始腐烂；出现雌雄产卵排精现象，精卵排放后不扩散。氨氮低浓度组，偏顶蛤短时间内（24 h）不出现中毒症状，随着胁迫时间的延长而逐渐表现出中毒症状；低浓度亚硝酸氮组偏顶蛤中毒症状较早出现。
3.2.2毒性比较。
该试验结果表明，偏顶蛤对总氨的96 h半致死浓度是亚硝酸氮的2.95倍，而偏顶蛤对亚硝酸氮96 h半致死浓度是非离子氨的3.83倍，表明非离子氨对偏顶蛤的毒性远大于亚硝酸氮的毒性，因此非离子氨毒性在偏顶蛤增养殖过程中应着重考虑。王娟等[18]研究亚硝酸盐和氨氮对中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）急性毒性效应得出了相似的结论。与氨氮毒性相比，偏顶蛤对低浓度亚硝酸氮毒性更为敏感，据此推测这可能与偏顶蛤生存水体中高氨氮低亚硝酸氮有关。
3.3氨氮和亚硝酸氮的防控措施
养殖水体中氨氮和亚硝酸氮对生物有机体的毒性受多种因子的影响，如pH、温度、盐度、溶解氧、受试动物规格和生理状态[19-24]。相关研究表明，盐度越低，氨氮和亚硝酸氮毒性越强[20-21，23]，适当增加盐度有助于缓解养殖水体中氨氮和亚硝酸氮的毒性。海水pH对氨氮毒性的影响显著，pH越高，氨氮毒性越强。相关研究表明，pH升高1.0，则氨氮毒性增强近10倍[20]；海水中亚硝酸氮的毒性随pH的升高而降低[22]。因此，维持养殖水环境中适宜pH十分关键，高密度养殖水产动物时应做到长期监测，定期调整。同时，适当增加溶解氧可以有效降低水体中氨氮和亚硝酸氮的毒性[24]。因此，水产动物养殖过程中应保证养殖水体充足的曝气时间，维持较高的溶氧量。此外，控制水产动物放养密度，以减少自身污染，使用生态制剂来改良水质，定期倒池、清塘消毒等均可以有效降低养殖水环境中氨氮和亚硝酸氮的毒性。 参考文献
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