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摘要[目的]对分离自不同产地和品种的蜂蜜中的芽孢杆菌属进行鉴定分型，探索利用蜂蜜中芽孢杆菌特征指纹图谱对蜂蜜产地和品种进行溯源的可行性。[方法] 从44种不同产地和品种蜂蜜中分离出44株芽孢杆菌，3株铜绿假单胞菌。采用基质辅助激光解析-电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）条件对分离的芽孢杆菌进行鉴定分型和聚类分析。[结果] 44株芽孢杆菌中鉴定出蜡样芽孢杆菌（B.cereus ）31株，短小芽孢杆菌（B.pumilus）5株，枯草芽孢杆菌（B.subtilis）3株，地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）2株，炭疽芽孢杆菌（B.anthracis）1株，土壤短芽孢杆菌（Brevibacillus agri.）2株。通过多次重复试验，表明从同一份样品或同一品牌蜂蜜样品中能稳定分离到芽孢杆菌，获得的蛋白指纹图谱具有极好的稳定性。[结论]MALDITOFMS可根据获得的芽孢杆菌蛋白指纹图谱将芽孢杆菌划分为不同类型，可作为一种新的根据蜂蜜中芽孢杆菌的特征指纹图谱进行溯源的方法。
关键词基质辅助激光解析-电脑飞行时间质谱；芽孢杆菌；鉴定分析
中图分类号S896.1文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）08-107-03
Abstract[Objective] The species of the genus Bacillus isolated from different habitats and species honey were identified. The feasibility of using Bacillus characteristic fingerprint in honey to trace the origin and species of honey was explored. [Method] Fortyfour strains of Bacillus and three strains of Pseudomonas aeruginosa were isolated from fortyfour different varieties of honey. Using matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry （MALDITOFMS）， cluster analysis and typing of Bacillus isolated from honey was conducted. [Result] Thirtyone strains of Bacillus cereus， five strains of Bacillus pumilus， three strains of Bacillus subtilis， two strains of Bacillus licheniformis， one strain of Bacillus anthracis， and two strains of Brevibacillus agri. were identified from fortyfour strains of Bacillus. The result from repeated experiments indicated that stabilized Bacillus could be isolated from the same one or brand of honey so that obtained proteome profiles were more stabilized. [Conclusion] MALDITOFMS can divide Bacillus into different types on the basis of the proteome profiles of obtained Bacillus and as a new method to trace the origin of honey based on the characteristic fingerprint of honey.
Key wordsMALDITOFMS； Bacillus； Identification and analysis
蜂蜜的成分复杂，营养丰富，是人类传统的天然营养保健品。我国是蜂蜜生产、销售和出口大国，随着蜂产品市场日益繁荣，蜂产品的质量安全问题逐渐突显。蜂蜜产品的溯源检测技术在蜂蜜溯源体系中起到了极为重要的技术支持作用。目前，溯源分析中涉及的检测技术主要有色谱、质谱、光谱和分子生物学等。其中，质谱检测技术作为溯源检测技术的重要组成部分，在溯源分析中发挥了极为重要的作用。目前采用质谱技术对蜂产品进行溯源主要是对蜂蜜中有机成分、 挥发性物质、 特征化合物和同位素比率等进行分析检测，从而对不同种类的蜂蜜进行溯源分析。笔者主要研究了多个产地和品种的蜂蜜中芽孢杆菌的特征蛋白质指纹峰，建立蜂蜜中芽孢杆菌蛋白质指纹图谱库对蜂蜜产品进行溯源，开拓了蜂蜜溯源技术的新思路。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1蜂蜜样品。供试样品为不同产地不同品种的蜂蜜，均由安徽省阜阳市百和食品有限公司提供。样品采集后置于4 ℃冰箱保存。
1.1.2培养基。营养肉汤培养基。
1.1.3MALDITOFMS基质和溶液系统。基质：α氰基4羟基肉桂酸（αcyan o4hydroxycinnamic acid，CHCA）， 岛津公司。溶剂：检测样品配制基质的溶剂为乙腈∶乙醇∶ 水 （1∶1∶1） 。以大肠杆菌ATCC8739作为标准菌株，用来校准仪器。MALDITOFMS基质溶液是用溶剂将基质配成饱和溶液，基质溶液现用现配。 1.1.4仪器与设备。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪，日本岛津公司confidence，仪器参数为：线性操作模式，正离子，基质抑制偏转模式，脉冲离子提取时间350 ns，质量范围1 500～15 000 D，激光点击数为20。每次试验前都要处理好的大肠杆菌ATCC8739的标准峰图在采集数据的质量范围内（1 500～15 000 D） 进行质量校正，校正完毕后方可进行质谱图数据的采集。
1.2方法
1.2.1从蜂蜜中分离芽孢杆菌。
称取1 g蜂蜜，加入配制好的营养肉汤中，37 ℃培养24～48 h，然后划线于血平板上，将划线后血平板37 ℃培养24 h，挑单菌落再划线于新的血平板上培养24 h。
1.2.2MALDITOFMS质谱上样前处理。无菌操作挑取100 mg左右血平板上菌落于1.5 mL EP管中（1.5 mL EP管预先加入0.5 mL生理盐水），振荡1 min后离心，将底部菌落用300 μl 蒸馏水转于EP管中， 加900 μL无水乙醇，振荡2 min后12 000 r/min离心2 min，弃去上清液，室温放置10 min，沉淀中加30 μL 70%甲酸，振荡混匀，超声15 min，加30 μL乙腈，振荡混匀， 8 000 r/min再次离心1 min后迅速将上清液转入新的EP管中。取0.5 μL置于MALDITOFMS样品靶盘上，室温晾干后迅速用0.5 μL基质溶液覆盖，在空气中晾干。作为校准用的大肠杆菌ATCC8739培养及前处理过程与蜂蜜样品中芽孢杆菌分离培养及前处理相同。每个样品各点3个平行孔。
2结果与分析
2.1MALDITOFMS对蜂蜜中分离菌株的鉴定
比对44个不同产地和品种蜂蜜中分离的44株芽孢杆菌和3株铜绿假单胞菌。44株芽孢杆菌中鉴定出蜡样芽孢杆菌（B.cereus ）31株，短小芽孢杆菌（B.pumilus）5株，枯草芽孢杆菌（B.subtilis）3株，地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）2株，炭疽芽孢杆菌（B.anthracis）1株，土壤短芽孢杆菌（Brevibacillus agri.）2株。鉴定的代表性图谱，具体统计数据见表1。
由表1可以看出，分离自44个不同产地和品种的蜂蜜的44张芽孢杆菌质量图谱，既存在相似的离子峰，也大多数有各自的特征离子峰，且通过多次重复取样试验，这种差异特征离子峰检测重复性和稳定都非常好，因此可以把这些特征峰代表的特征指纹图谱作为某一产地和品种品牌蜂蜜的参考标记峰，作为蜂蜜产地、品种甚至品牌的溯源根据。
2.2MALDITOFMS对芽孢杆菌的分型
将所得31株蜡样芽孢杆菌的蛋白指纹图谱导入微生物鉴定数据库，通过软件自带TAXMONY功能将蜡样芽孢杆菌31株菌的蛋白质指纹图谱进行聚类分析（图2），按照65%相似性作为判定水平，170001_2G3、220002_2A4、1600001_2C1、240001_2A1、210001_2G1菌株肽指纹图谱较为相近，140001_2F1、470002_2C4、250001_2H1、46-20001_2E3、330002_2E4、161-20001_2E3、190001_2H3、430002_2E2菌株肽指纹图谱较为相近。
3讨论
蜂蜜主要成分为糖类物质，其中主要是葡萄糖和果糖，在高糖的环境下仅有部分微生物能存活，其中芽孢杆菌因为其耐受的芽孢体的存在而广泛存在于蜂蜜中。通过试验，从44种蜂蜜中（包括40种原蜜和4种商品蜜）均分离到了芽孢杆菌，其中主要为蜡样芽孢杆菌，其次为枯草芽孢杆菌，还有些是短小芽孢杆菌等。通过对这些芽孢杆菌多次划板分离得到其纯培养物，采用简单前处理获得较高的鉴定率。从表1 中可以看到，从各类蜂蜜中分离出来的芽孢杆菌的鉴定率基本上在80%以上，为可信结果（>75%）。每株从各类蜂蜜中分离出来的芽孢杆菌图谱除存在共有峰外，还存在各自的特征峰，且稳定性和重复性好。
基于单菌落的 MALDITOFMS 技术用于芽孢杆菌鉴定，与目前的细菌鉴定方法[1-2]相比，其原理和操作均存在差异，无需复杂的前处理，只需获得某细菌纯培养物，进行简单前处理甚至不需要进行任何的前处理，只需将极少量的纯培养物涂抹于靶板表面，再覆盖少量基质，即可上机鉴定，获得稳定的细菌肽指纹图谱，图谱数据自动分析、检索与比对，实现了一种高通量和高效率的鉴定方法。在应用MALDITOFMS分析全细菌时，获取的全细菌指纹图谱还具有很好的重现性和稳定性[3-4]。
岛津公司MALDITOFMS confidence型号质谱所带的微生物数据库中，蜡样芽孢杆菌普通图谱仅有19份，超级图谱仅有5份，枯草芽孢杆菌普通图谱仅有20份，超级图谱仅有6份。该研究从蜂蜜中分离的各类芽孢杆菌十分丰富，通过鉴定后均可将其肽指纹图谱加入微生物数据库中，以丰富数据库中芽孢杆菌的标准图谱数量。
参考文献
[1]
赵贵明，杨海荣，赵勇胜，等.MALDITOF 质谱技术对克罗诺杆菌的鉴定与分型[J].微生物学通报，2010， 37（8）： 1169-1175.
[2] 吕 佳，卢行安，刘淑艳，等.MALDITOFMS技术鉴定食源性致病菌的影响因素[J].分析仪器，2011（2）：12-17.
[3] 谢田刚，王运铎，郑秋月，等.铜绿假单胞菌的 MALDITOFMS 检测方法的建立[J].中国微生态学杂志，2012，24（10）：938-940.
[4] 王晔茹， 崔生辉， 李凤琴.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在沙门菌检测和鉴定分型中的应用研究[J].卫生研究，2008，37（6）：685-689.
关键词基质辅助激光解析-电脑飞行时间质谱；芽孢杆菌；鉴定分析
中图分类号S896.1文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）08-107-03
Abstract[Objective] The species of the genus Bacillus isolated from different habitats and species honey were identified. The feasibility of using Bacillus characteristic fingerprint in honey to trace the origin and species of honey was explored. [Method] Fortyfour strains of Bacillus and three strains of Pseudomonas aeruginosa were isolated from fortyfour different varieties of honey. Using matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry （MALDITOFMS）， cluster analysis and typing of Bacillus isolated from honey was conducted. [Result] Thirtyone strains of Bacillus cereus， five strains of Bacillus pumilus， three strains of Bacillus subtilis， two strains of Bacillus licheniformis， one strain of Bacillus anthracis， and two strains of Brevibacillus agri. were identified from fortyfour strains of Bacillus. The result from repeated experiments indicated that stabilized Bacillus could be isolated from the same one or brand of honey so that obtained proteome profiles were more stabilized. [Conclusion] MALDITOFMS can divide Bacillus into different types on the basis of the proteome profiles of obtained Bacillus and as a new method to trace the origin of honey based on the characteristic fingerprint of honey.
Key wordsMALDITOFMS； Bacillus； Identification and analysis
蜂蜜的成分复杂，营养丰富，是人类传统的天然营养保健品。我国是蜂蜜生产、销售和出口大国，随着蜂产品市场日益繁荣，蜂产品的质量安全问题逐渐突显。蜂蜜产品的溯源检测技术在蜂蜜溯源体系中起到了极为重要的技术支持作用。目前，溯源分析中涉及的检测技术主要有色谱、质谱、光谱和分子生物学等。其中，质谱检测技术作为溯源检测技术的重要组成部分，在溯源分析中发挥了极为重要的作用。目前采用质谱技术对蜂产品进行溯源主要是对蜂蜜中有机成分、 挥发性物质、 特征化合物和同位素比率等进行分析检测，从而对不同种类的蜂蜜进行溯源分析。笔者主要研究了多个产地和品种的蜂蜜中芽孢杆菌的特征蛋白质指纹峰，建立蜂蜜中芽孢杆菌蛋白质指纹图谱库对蜂蜜产品进行溯源，开拓了蜂蜜溯源技术的新思路。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1蜂蜜样品。供试样品为不同产地不同品种的蜂蜜，均由安徽省阜阳市百和食品有限公司提供。样品采集后置于4 ℃冰箱保存。
1.1.2培养基。营养肉汤培养基。
1.1.3MALDITOFMS基质和溶液系统。基质：α氰基4羟基肉桂酸（αcyan o4hydroxycinnamic acid，CHCA）， 岛津公司。溶剂：检测样品配制基质的溶剂为乙腈∶乙醇∶ 水 （1∶1∶1） 。以大肠杆菌ATCC8739作为标准菌株，用来校准仪器。MALDITOFMS基质溶液是用溶剂将基质配成饱和溶液，基质溶液现用现配。 1.1.4仪器与设备。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪，日本岛津公司confidence，仪器参数为：线性操作模式，正离子，基质抑制偏转模式，脉冲离子提取时间350 ns，质量范围1 500～15 000 D，激光点击数为20。每次试验前都要处理好的大肠杆菌ATCC8739的标准峰图在采集数据的质量范围内（1 500～15 000 D） 进行质量校正，校正完毕后方可进行质谱图数据的采集。
1.2方法
1.2.1从蜂蜜中分离芽孢杆菌。
称取1 g蜂蜜，加入配制好的营养肉汤中，37 ℃培养24～48 h，然后划线于血平板上，将划线后血平板37 ℃培养24 h，挑单菌落再划线于新的血平板上培养24 h。
1.2.2MALDITOFMS质谱上样前处理。无菌操作挑取100 mg左右血平板上菌落于1.5 mL EP管中（1.5 mL EP管预先加入0.5 mL生理盐水），振荡1 min后离心，将底部菌落用300 μl 蒸馏水转于EP管中， 加900 μL无水乙醇，振荡2 min后12 000 r/min离心2 min，弃去上清液，室温放置10 min，沉淀中加30 μL 70%甲酸，振荡混匀，超声15 min，加30 μL乙腈，振荡混匀， 8 000 r/min再次离心1 min后迅速将上清液转入新的EP管中。取0.5 μL置于MALDITOFMS样品靶盘上，室温晾干后迅速用0.5 μL基质溶液覆盖，在空气中晾干。作为校准用的大肠杆菌ATCC8739培养及前处理过程与蜂蜜样品中芽孢杆菌分离培养及前处理相同。每个样品各点3个平行孔。
2结果与分析
2.1MALDITOFMS对蜂蜜中分离菌株的鉴定
比对44个不同产地和品种蜂蜜中分离的44株芽孢杆菌和3株铜绿假单胞菌。44株芽孢杆菌中鉴定出蜡样芽孢杆菌（B.cereus ）31株，短小芽孢杆菌（B.pumilus）5株，枯草芽孢杆菌（B.subtilis）3株，地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）2株，炭疽芽孢杆菌（B.anthracis）1株，土壤短芽孢杆菌（Brevibacillus agri.）2株。鉴定的代表性图谱，具体统计数据见表1。
由表1可以看出，分离自44个不同产地和品种的蜂蜜的44张芽孢杆菌质量图谱，既存在相似的离子峰，也大多数有各自的特征离子峰，且通过多次重复取样试验，这种差异特征离子峰检测重复性和稳定都非常好，因此可以把这些特征峰代表的特征指纹图谱作为某一产地和品种品牌蜂蜜的参考标记峰，作为蜂蜜产地、品种甚至品牌的溯源根据。
2.2MALDITOFMS对芽孢杆菌的分型
将所得31株蜡样芽孢杆菌的蛋白指纹图谱导入微生物鉴定数据库，通过软件自带TAXMONY功能将蜡样芽孢杆菌31株菌的蛋白质指纹图谱进行聚类分析（图2），按照65%相似性作为判定水平，170001_2G3、220002_2A4、1600001_2C1、240001_2A1、210001_2G1菌株肽指纹图谱较为相近，140001_2F1、470002_2C4、250001_2H1、46-20001_2E3、330002_2E4、161-20001_2E3、190001_2H3、430002_2E2菌株肽指纹图谱较为相近。
3讨论
蜂蜜主要成分为糖类物质，其中主要是葡萄糖和果糖，在高糖的环境下仅有部分微生物能存活，其中芽孢杆菌因为其耐受的芽孢体的存在而广泛存在于蜂蜜中。通过试验，从44种蜂蜜中（包括40种原蜜和4种商品蜜）均分离到了芽孢杆菌，其中主要为蜡样芽孢杆菌，其次为枯草芽孢杆菌，还有些是短小芽孢杆菌等。通过对这些芽孢杆菌多次划板分离得到其纯培养物，采用简单前处理获得较高的鉴定率。从表1 中可以看到，从各类蜂蜜中分离出来的芽孢杆菌的鉴定率基本上在80%以上，为可信结果（>75%）。每株从各类蜂蜜中分离出来的芽孢杆菌图谱除存在共有峰外，还存在各自的特征峰，且稳定性和重复性好。
基于单菌落的 MALDITOFMS 技术用于芽孢杆菌鉴定，与目前的细菌鉴定方法[1-2]相比，其原理和操作均存在差异，无需复杂的前处理，只需获得某细菌纯培养物，进行简单前处理甚至不需要进行任何的前处理，只需将极少量的纯培养物涂抹于靶板表面，再覆盖少量基质，即可上机鉴定，获得稳定的细菌肽指纹图谱，图谱数据自动分析、检索与比对，实现了一种高通量和高效率的鉴定方法。在应用MALDITOFMS分析全细菌时，获取的全细菌指纹图谱还具有很好的重现性和稳定性[3-4]。
岛津公司MALDITOFMS confidence型号质谱所带的微生物数据库中，蜡样芽孢杆菌普通图谱仅有19份，超级图谱仅有5份，枯草芽孢杆菌普通图谱仅有20份，超级图谱仅有6份。该研究从蜂蜜中分离的各类芽孢杆菌十分丰富，通过鉴定后均可将其肽指纹图谱加入微生物数据库中，以丰富数据库中芽孢杆菌的标准图谱数量。
参考文献
[1]
赵贵明，杨海荣，赵勇胜，等.MALDITOF 质谱技术对克罗诺杆菌的鉴定与分型[J].微生物学通报，2010， 37（8）： 1169-1175.
[2] 吕 佳，卢行安，刘淑艳，等.MALDITOFMS技术鉴定食源性致病菌的影响因素[J].分析仪器，2011（2）：12-17.
[3] 谢田刚，王运铎，郑秋月，等.铜绿假单胞菌的 MALDITOFMS 检测方法的建立[J].中国微生态学杂志，2012，24（10）：938-940.
[4] 王晔茹， 崔生辉， 李凤琴.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在沙门菌检测和鉴定分型中的应用研究[J].卫生研究，2008，37（6）：685-689.