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摘要：目的 观察抵挡汤早期干预对2型糖尿病大鼠血管病变中大血管的保护作用，探讨其机制。方法 采用高脂饲料喂养及链脲佐菌素诱导方法制成大鼠糖尿病模型，抵挡汤早期干预组、抵挡汤中期干预组和抵挡汤晚期干预组分别于实验成模前4周、成模和成模后4周给予抵挡汤灌胃，辛伐他汀组和罗格列酮组大鼠于成模时分别给予辛伐他汀和罗格列酮灌胃，至实验24周时结束。酶联免疫吸附法检测大鼠血清血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）水平，实时荧光定量PCR法检测主动脉肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA表达。结果 与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清VCAM-1水平明显升高（P<0.05），主动脉TNF-α mRNA表达明显升高（P<0.05）；与模型对照组比较，抵挡汤早期干预组和辛伐他汀组大鼠血清VCAM-1水平明显降低（P<0.05），并且抵挡汤早期干预组、抵挡汤中期干预组和罗格列酮组大鼠主动脉TNF-α mRNA的表达明显降低（P<0.05）。结论 抵挡汤早期干预能抑制大鼠主动脉TNF-α mRNA表达升高，抑制大血管病变的炎性损伤，延缓糖尿病大血管病变的发展，发挥其保护大血管的作用。
关键词：抵挡汤；糖尿病；大血管病变；肿瘤坏死因子-α；血管细胞黏附分子-1；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0038-03
糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者并发心血管疾病是其动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的加速造成的[1]。虽然已有研究认为严格控制血糖可减少1型DM患者心血管疾病的发生，但是对2型DM患者所作的临床试验结果却与此不同[2]。近年来DM的瘀血病机日益受到重视。抵挡汤出自东汉张仲景《伤寒杂病论》，由大黄、桃仁、虻虫、水蛭4味中药组成，是治疗蓄血实证的经典破血逐瘀名方。笔者通过建立2型DM大鼠模型，观察抵挡汤早期干预对DM大鼠主动脉肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达及血清血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）水平等的影响，进一步探讨抵挡汤在DM大血管病变中对大血管的保护作用及其相关机制。
1 实验材料
1.1 动物
雄性SD大鼠，4周龄，体质量（100.30±2.19）g，天津实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（津）2005-001。
1.2 药物
抵挡汤（桃仁10 g，水蛭10 g，虻虫10 g，大黄6 g）原药材购于天津中医药大学第一附属医院药剂科，按传统工艺制备水煎剂，减压浓缩至浓度为1 g/mL，4 ℃保存备用。罗格列酮由葛兰素史克公司生产，规格4 mg/片，批号H20000013。辛伐他汀由辉瑞制药有限公司生产，规格10 mg/片，批号H10970385。
1.3 试剂与仪器
酶联免疫吸附法（ELISA）检测VCAM-1试剂盒（美国BD公司），实时荧光定量PCR（RT-PCR）试剂盒（Real Master Mix，天根生化科技有限公司）。台式低温高速离心机，光密度扫描仪，PCR扩增仪，R2100C酶标仪。
2 实验方法
2.1 造模与分组
SD大鼠适应性喂养1周后，随机抽取20只作为正常对照组，给予标准饲料喂养，其余为造模组给予高脂饲料（20%蔗糖+1%胆固醇+10%猪油+5%蛋黄粉+0.2%胆酸钠+63.8%基础饲料，均购自天津实验动物中心实验室）喂养。8周后，随机选取造模组20只大鼠作为抵挡汤早期干预组灌胃，灌胃4周后开始造模。除正常对照组外，其他大鼠尾静脉注射链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）30 mg/kg，3 d后测随机血糖高于16.7 mmol/L确定造模成功。造模成功后大鼠（正常对照组、抵挡汤早期干预组除外）按血糖、体质量随机分为抵挡汤中期干预组、抵挡汤晚期干预组、罗格列酮组、辛伐他汀组、模型对照组。
2.2 实验干预及标本采集
所有给药组均以体表面积折合成等效剂量给药。抵挡汤早期、中期、晚期组分别于造模4周前、成模、成模后4周给予抵挡汤原药材3.24 g/（kg·d）灌胃，罗格列酮组和辛伐他汀组成模后分别给予罗格列酮[0.36 mg/（kg·d）]和辛伐他汀
[1.8 mg/（kg·d）]灌胃。实验于24周时结束，于股动脉取血后颈椎脱臼处死大鼠，迅速取胸主动脉组织，放入冻存管中，置于液氮中，后转移至-80 ℃冰箱保存，用于RNA提取。
2.3 指标检测
取大鼠血清，用ELISA法检测VCAM-1水平。大鼠主动脉组织约50 mg，加入1 mL Trizol试剂提取RNA，所用RNA的A260/A280均在1.8～2.0之间。使用BioDev RT-PCR kit进行模板cDNA合成，条件为42 ℃、2 h，95 ℃、5 min，RT产物置-20 ℃保存。根据GenBank中β-actin、TNF-α的基因序列设计相应引物；RT-PCR过程根据试剂盒说明进行。反应条件为：95 ℃预变性15 min，1个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环。绘制溶解曲线。RT-PCR结果由荧光定量分析仪自动采集给出目的基因和对照基因的Ct值，参照文献将Ct值转化为相对倍数，基因表达量采用实验组/对照组=2-△△Ct进行计算，其中△△Ct=（Ct目的-Ct对照）实验-（Ct目的-Ct对照）对照。扩增的PCR产物同时进行琼脂糖凝胶电泳对产物进行确定分析。
3 统计学方法
采用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较时，组间方差齐性的采用LSD法，方差不齐的采用DUNNET'S T3法。P<0.05为差异有统计学意义。 4 结果
4.1 糖尿病模型大鼠相关指标检测
在实验第12周时，与正常对照组比较，高脂饲料喂养的造模组大鼠（造模前）胰岛素有所升高，其差异有统计学意义（P<0.01）；胰岛素敏感指数显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与正常对照组比较，13周时（造模后）造模组大鼠空腹血糖明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01），表明高脂饲料喂养配合STZ诱导的2型DM大鼠模型成功建立。见表1、表2。
4.2 抵挡汤早期干预对2型糖尿病大鼠血清血管细胞黏附分子-1水平的影响（见表3）
4.3 抵挡汤早期干预对2型糖尿病大鼠主动脉肿瘤坏死因子-α mRNA表达的影响（见表4）
5 讨论
高剂量一次性注射STZ可诱发1型DM模型，而低剂量注射STZ并配合高脂饲料可诱发2型DM动物模型[3]。2型DM是以胰岛素抵抗和持续高血糖为主要特征的代谢紊乱综合征。本实验采用高糖高脂饲料配合低剂量STZ尾静脉单次注射的方法成功建立2型DM大鼠模型。
AS是一种炎症性疾病，其中体内TNF-α与VCAM-1等分子的增加是其主要标志。高胰岛素血症是胰岛素抵抗的一个标志，其在这种炎症过程中可能发挥了关键作用。AS是心血管疾病的主要危险因子，血脂异常和单核细胞黏附于血管内皮细胞并迁入内皮、摄取脂质转化为泡沫是AS形成的早期事件。VCAM-1在介导单核细胞与血管内皮细胞黏附及其相互作用方面起极其重要的作用，降低AS相关细胞黏附分子的表达或功能可抑制或减慢AS发生[4]。
TNF-α又称“前炎症细胞因子”，是一种非糖基化蛋白，主要由单核-巨噬细胞、T淋巴细胞及脂肪细胞等分泌，是一种有多种生物学功能的生物因子，参与免疫细胞激活，促进炎症细胞聚集和使微血管扩张，通透性增加，诱发炎症反应，在胰岛抵抗机制中起重要作用。2型DM的主要生理基础是胰岛素抵抗，流行病学和实验研究表明炎症和胰岛素抵抗之间存在相关关系，推测炎症可能为促进胰岛素抵抗的一个重要因素[5]。胰岛素抵抗过程中的炎性反应通常引起机体异常细胞因子产生和炎症信号转导通路的激活，从而释放各种炎性因子和炎性介质如TFN-α等，进而引起胰岛素抵抗和胰岛素分泌功能障碍。
VCAM-1作为一种重要的细胞黏附分子，属免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IGSF）成员，在受到致炎因子刺激时表达会增加，参与淋巴细胞的活化、迁移和造血细胞的生长发育，并在炎症、肿瘤转移等病理过程中起重要作用[6]。
炎症细胞与血管内皮细胞发生黏附是炎症反应的关键步骤。活化的血管内皮细胞可大量表达VCAM-1，并反过来促进血管内皮的损伤，VCAM-1的水平可反映血管内皮细胞的激活状态。有研究显示，VCAM-1独立于经典的高危因素，是预测心血管病未来死亡率最为显著而独立的标记物[7]。
VCAM-1又是一种可上调胰岛素抵抗和高胰岛素血症状态的黏附分子，这种上调会引起炎症反应和血管重塑，导致动脉管腔闭塞。TNF-α会刺激VCAM-1表达增加。VCAM-1上调会引起血液中单核细胞黏附到动脉内皮，从血管内膜迁移到中膜，并分泌TNF-α和其他炎性细胞因子，从根本上激发了正反馈过程[8]。
中医学认为，DM血管病变的发生是因消渴日久，气阴两虚，以致气虚行血无力，阴虚脉道失濡而滞涩，终致瘀血阻滞脉道而成。因此，气阴两虚、瘀血阻滞是DM血管病变发生、发展的基本病机。抵挡汤方中水蛭咸苦性平，入肝、膀胱二经，专攻逐恶血瘀血，破血癥积聚；虻虫破血逐瘀之力更峻；大黄荡涤邪热，导瘀下行；桃仁破血行血[9]。
本实验结果显示，抵挡汤早期干预能显著降低2型DM大鼠血清VCAM-1水平，抑制大鼠主动脉TNF-α mRNA表达升高，提示抵挡汤早期干预通过抑制主动脉TNF-α表达，降低VCAM-1水平，从而降低胰岛素抵抗、抑制大血管病变的炎性损伤，起到对大血管的保护作用。关于抵挡汤干预对DM大血管病变的多方面作用靶点及其机制还有待于进一步研究。
参考文献：
[1] Mulder H. Matrix metalloproteinases：keys to healthier blood vessels in diabetes？[J]. J Endocrinol，2011，210（1）：1-2.
[2] Parathath S， Grauer L， Huang LS， et al. Diabetes adversely affects macrophages during atherosclerotic plaque regression in mice[J]. Diabetes，2011，60（6）：1759-1769.
[3] Rosen DA， Hung CS， Kline KA， et al. Streptozotocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection[J]. Infect Immun， 2008，76（9）：4290-4298.
[4] 关立克，王淑兰.芝麻素对动脉硬化斑块形成及主动脉壁血管细胞黏附分子-1表达的影响[J].现代预防医学，2009，36（15）：2958-2960.
[5] Lazar MA. How obesity causes diabetes not a tall tale[J]. Science，2005，307（5708）：373-375.
[6] 张丽慧，魏尔清.ICAM-1、VCAM-1在脑缺血损伤炎症机制中的作用及调控[J].中国药理学通报，2005，21（11）：1281-1284.
[7] 刘会武，张艳，孙江波.益气活血复方对兔颈总动脉球囊损伤后VCAM-1表达的影响[J].军医进修学院学报，2010，31（1）：75-77.
[8] Mackesy DZ， Goalstone ML. Insulin augments tumor necrosis factor-alpha stimulated expression of vascular cell adhesion molecule-1 in vascular endothelial cells[J]. J Inflam （Lond），
2011，17（8）：34.
[9] 王珍，罗爱鄂.抵挡汤加味治疗子宫内膜异位症80例[J].广西中医药， 2009，32（1）：19-20.
（收稿日期：2012-05-07，编辑：华强）
关键词：抵挡汤；糖尿病；大血管病变；肿瘤坏死因子-α；血管细胞黏附分子-1；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0038-03
糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者并发心血管疾病是其动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的加速造成的[1]。虽然已有研究认为严格控制血糖可减少1型DM患者心血管疾病的发生，但是对2型DM患者所作的临床试验结果却与此不同[2]。近年来DM的瘀血病机日益受到重视。抵挡汤出自东汉张仲景《伤寒杂病论》，由大黄、桃仁、虻虫、水蛭4味中药组成，是治疗蓄血实证的经典破血逐瘀名方。笔者通过建立2型DM大鼠模型，观察抵挡汤早期干预对DM大鼠主动脉肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达及血清血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）水平等的影响，进一步探讨抵挡汤在DM大血管病变中对大血管的保护作用及其相关机制。
1 实验材料
1.1 动物
雄性SD大鼠，4周龄，体质量（100.30±2.19）g，天津实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（津）2005-001。
1.2 药物
抵挡汤（桃仁10 g，水蛭10 g，虻虫10 g，大黄6 g）原药材购于天津中医药大学第一附属医院药剂科，按传统工艺制备水煎剂，减压浓缩至浓度为1 g/mL，4 ℃保存备用。罗格列酮由葛兰素史克公司生产，规格4 mg/片，批号H20000013。辛伐他汀由辉瑞制药有限公司生产，规格10 mg/片，批号H10970385。
1.3 试剂与仪器
酶联免疫吸附法（ELISA）检测VCAM-1试剂盒（美国BD公司），实时荧光定量PCR（RT-PCR）试剂盒（Real Master Mix，天根生化科技有限公司）。台式低温高速离心机，光密度扫描仪，PCR扩增仪，R2100C酶标仪。
2 实验方法
2.1 造模与分组
SD大鼠适应性喂养1周后，随机抽取20只作为正常对照组，给予标准饲料喂养，其余为造模组给予高脂饲料（20%蔗糖+1%胆固醇+10%猪油+5%蛋黄粉+0.2%胆酸钠+63.8%基础饲料，均购自天津实验动物中心实验室）喂养。8周后，随机选取造模组20只大鼠作为抵挡汤早期干预组灌胃，灌胃4周后开始造模。除正常对照组外，其他大鼠尾静脉注射链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）30 mg/kg，3 d后测随机血糖高于16.7 mmol/L确定造模成功。造模成功后大鼠（正常对照组、抵挡汤早期干预组除外）按血糖、体质量随机分为抵挡汤中期干预组、抵挡汤晚期干预组、罗格列酮组、辛伐他汀组、模型对照组。
2.2 实验干预及标本采集
所有给药组均以体表面积折合成等效剂量给药。抵挡汤早期、中期、晚期组分别于造模4周前、成模、成模后4周给予抵挡汤原药材3.24 g/（kg·d）灌胃，罗格列酮组和辛伐他汀组成模后分别给予罗格列酮[0.36 mg/（kg·d）]和辛伐他汀
[1.8 mg/（kg·d）]灌胃。实验于24周时结束，于股动脉取血后颈椎脱臼处死大鼠，迅速取胸主动脉组织，放入冻存管中，置于液氮中，后转移至-80 ℃冰箱保存，用于RNA提取。
2.3 指标检测
取大鼠血清，用ELISA法检测VCAM-1水平。大鼠主动脉组织约50 mg，加入1 mL Trizol试剂提取RNA，所用RNA的A260/A280均在1.8～2.0之间。使用BioDev RT-PCR kit进行模板cDNA合成，条件为42 ℃、2 h，95 ℃、5 min，RT产物置-20 ℃保存。根据GenBank中β-actin、TNF-α的基因序列设计相应引物；RT-PCR过程根据试剂盒说明进行。反应条件为：95 ℃预变性15 min，1个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环。绘制溶解曲线。RT-PCR结果由荧光定量分析仪自动采集给出目的基因和对照基因的Ct值，参照文献将Ct值转化为相对倍数，基因表达量采用实验组/对照组=2-△△Ct进行计算，其中△△Ct=（Ct目的-Ct对照）实验-（Ct目的-Ct对照）对照。扩增的PCR产物同时进行琼脂糖凝胶电泳对产物进行确定分析。
3 统计学方法
采用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较时，组间方差齐性的采用LSD法，方差不齐的采用DUNNET'S T3法。P<0.05为差异有统计学意义。 4 结果
4.1 糖尿病模型大鼠相关指标检测
在实验第12周时，与正常对照组比较，高脂饲料喂养的造模组大鼠（造模前）胰岛素有所升高，其差异有统计学意义（P<0.01）；胰岛素敏感指数显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与正常对照组比较，13周时（造模后）造模组大鼠空腹血糖明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01），表明高脂饲料喂养配合STZ诱导的2型DM大鼠模型成功建立。见表1、表2。
4.2 抵挡汤早期干预对2型糖尿病大鼠血清血管细胞黏附分子-1水平的影响（见表3）
4.3 抵挡汤早期干预对2型糖尿病大鼠主动脉肿瘤坏死因子-α mRNA表达的影响（见表4）
5 讨论
高剂量一次性注射STZ可诱发1型DM模型，而低剂量注射STZ并配合高脂饲料可诱发2型DM动物模型[3]。2型DM是以胰岛素抵抗和持续高血糖为主要特征的代谢紊乱综合征。本实验采用高糖高脂饲料配合低剂量STZ尾静脉单次注射的方法成功建立2型DM大鼠模型。
AS是一种炎症性疾病，其中体内TNF-α与VCAM-1等分子的增加是其主要标志。高胰岛素血症是胰岛素抵抗的一个标志，其在这种炎症过程中可能发挥了关键作用。AS是心血管疾病的主要危险因子，血脂异常和单核细胞黏附于血管内皮细胞并迁入内皮、摄取脂质转化为泡沫是AS形成的早期事件。VCAM-1在介导单核细胞与血管内皮细胞黏附及其相互作用方面起极其重要的作用，降低AS相关细胞黏附分子的表达或功能可抑制或减慢AS发生[4]。
TNF-α又称“前炎症细胞因子”，是一种非糖基化蛋白，主要由单核-巨噬细胞、T淋巴细胞及脂肪细胞等分泌，是一种有多种生物学功能的生物因子，参与免疫细胞激活，促进炎症细胞聚集和使微血管扩张，通透性增加，诱发炎症反应，在胰岛抵抗机制中起重要作用。2型DM的主要生理基础是胰岛素抵抗，流行病学和实验研究表明炎症和胰岛素抵抗之间存在相关关系，推测炎症可能为促进胰岛素抵抗的一个重要因素[5]。胰岛素抵抗过程中的炎性反应通常引起机体异常细胞因子产生和炎症信号转导通路的激活，从而释放各种炎性因子和炎性介质如TFN-α等，进而引起胰岛素抵抗和胰岛素分泌功能障碍。
VCAM-1作为一种重要的细胞黏附分子，属免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IGSF）成员，在受到致炎因子刺激时表达会增加，参与淋巴细胞的活化、迁移和造血细胞的生长发育，并在炎症、肿瘤转移等病理过程中起重要作用[6]。
炎症细胞与血管内皮细胞发生黏附是炎症反应的关键步骤。活化的血管内皮细胞可大量表达VCAM-1，并反过来促进血管内皮的损伤，VCAM-1的水平可反映血管内皮细胞的激活状态。有研究显示，VCAM-1独立于经典的高危因素，是预测心血管病未来死亡率最为显著而独立的标记物[7]。
VCAM-1又是一种可上调胰岛素抵抗和高胰岛素血症状态的黏附分子，这种上调会引起炎症反应和血管重塑，导致动脉管腔闭塞。TNF-α会刺激VCAM-1表达增加。VCAM-1上调会引起血液中单核细胞黏附到动脉内皮，从血管内膜迁移到中膜，并分泌TNF-α和其他炎性细胞因子，从根本上激发了正反馈过程[8]。
中医学认为，DM血管病变的发生是因消渴日久，气阴两虚，以致气虚行血无力，阴虚脉道失濡而滞涩，终致瘀血阻滞脉道而成。因此，气阴两虚、瘀血阻滞是DM血管病变发生、发展的基本病机。抵挡汤方中水蛭咸苦性平，入肝、膀胱二经，专攻逐恶血瘀血，破血癥积聚；虻虫破血逐瘀之力更峻；大黄荡涤邪热，导瘀下行；桃仁破血行血[9]。
本实验结果显示，抵挡汤早期干预能显著降低2型DM大鼠血清VCAM-1水平，抑制大鼠主动脉TNF-α mRNA表达升高，提示抵挡汤早期干预通过抑制主动脉TNF-α表达，降低VCAM-1水平，从而降低胰岛素抵抗、抑制大血管病变的炎性损伤，起到对大血管的保护作用。关于抵挡汤干预对DM大血管病变的多方面作用靶点及其机制还有待于进一步研究。
参考文献：
[1] Mulder H. Matrix metalloproteinases：keys to healthier blood vessels in diabetes？[J]. J Endocrinol，2011，210（1）：1-2.
[2] Parathath S， Grauer L， Huang LS， et al. Diabetes adversely affects macrophages during atherosclerotic plaque regression in mice[J]. Diabetes，2011，60（6）：1759-1769.
[3] Rosen DA， Hung CS， Kline KA， et al. Streptozotocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection[J]. Infect Immun， 2008，76（9）：4290-4298.
[4] 关立克，王淑兰.芝麻素对动脉硬化斑块形成及主动脉壁血管细胞黏附分子-1表达的影响[J].现代预防医学，2009，36（15）：2958-2960.
[5] Lazar MA. How obesity causes diabetes not a tall tale[J]. Science，2005，307（5708）：373-375.
[6] 张丽慧，魏尔清.ICAM-1、VCAM-1在脑缺血损伤炎症机制中的作用及调控[J].中国药理学通报，2005，21（11）：1281-1284.
[7] 刘会武，张艳，孙江波.益气活血复方对兔颈总动脉球囊损伤后VCAM-1表达的影响[J].军医进修学院学报，2010，31（1）：75-77.
[8] Mackesy DZ， Goalstone ML. Insulin augments tumor necrosis factor-alpha stimulated expression of vascular cell adhesion molecule-1 in vascular endothelial cells[J]. J Inflam （Lond），
2011，17（8）：34.
[9] 王珍，罗爱鄂.抵挡汤加味治疗子宫内膜异位症80例[J].广西中医药， 2009，32（1）：19-20.
（收稿日期：2012-05-07，编辑：华强）