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摘要 综述了20多年来转基因猪的研究概况，探讨了各种转基因技术的特点，分析了胞质内单精子注射制备转基因豬技术的特点和优势，并展望了单精子注射与人工染色体载体技术相结合制备大片段转基因猪的应用前景。
关键词 转基因；单精注射；人工染色体；猪胚胎
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02337-03
The Advantages and Prospect of Producing Transgenic Porcine by Intracytoplasmic Sperm Injection
HU Xiaorui， PAN Jianzhi et al
（Zhejiang Normal University， Jinhua， Zhejiang 321004； Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou， Zhejiang 310021）
Abstract The review was about the development of transgenic porcine in the last two decades. And the characteristics of different kinds of transgenic methods are discussed. This paper expounds the advantages of Intracytoplasmic Sperm Injection（ICSI） in producing transgenic porcine， and describes the application of producing large fragments of transgenic pigs by ICSI combined with artificial chromosome vectors technology.
Key words Transfer genes； ICSI； Artificial chromosome vectors； Pig embryo
猪的转基因技术研究具有重要的理论和商业价值[1]。利用猪的转基因技术能在较短时间内提高猪的生产性能和抗病能力，加快动物改良进程，培育出新的品种或种群；可用于研究未知基因的功能和关键基因的表达调控特点；也可作为生物反应器，还可为人异种器官移植提供供体等[2]。从技术角度来看，准备转基因胚胎是制作转基因猪的基础，因为外源基因导入的载体或途径不同，形成了各具特色和功效的转基因技术[3]。其中，以精子为载体的方法统称为精子介导转基因技术（Spermmediated gene Transfer，SMGT），受精过程的控制对于精子能否将外源基因携带进入成熟卵子，进而整合至受精卵基因组，是决定制备转基因胚胎成败的关键。笔者对卵细胞胞质内单精子注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技术在猪转基因中的应用进行了分析，以加深对这种转基因方法的优势和应用前景的了解。
1 转基因猪研究概况
猪既是重要的经济动物，也是人类医学研究的一个重要模型动物，因为从自然特性来看，其在解剖、组织、生理和营养代谢等方面与人类略接近。因此，无论从农业科技的角度还是人类医疗、基础研究等方面，各国学者对转基因猪的研究均极为重视。自1985年Hammer等得到第1批转基因猪以来，有关转基因猪的研究已有20多年的历史。对猪生产性能的遗传改良、作为生物反应器生产医用蛋白以及作为异种器官移植的供体等方面都取得了一系列重要的进展。
在国外，Lo等[4]将小鼠抗磷酰胆碱（PC）抗体的α+κ链融合基因注入猪的受精卵，获得的转基因猪中产生的单克隆抗体已被证实具有抗病活性。Brem等将小鼠抗流感基因导入猪的基因组，得到的转基因猪增强了对流感病毒的抵抗力。日本近畿大学入谷明教授等将菠菜 FAD12基因植入猪的受精卵中，成功培育出比普通猪不饱和脂肪酸含量高20%的转基因猪。Lai等[5]将取自秀丽线虫的FAT1基因导入猪的基因组，然后借助克隆技术培育出富含ω3脂肪酸的转基因猪。美国弗吉尼亚大学Willam等[6]成功构建了在乳腺中特异表达人蛋白C的转基因猪，其表达量是正常人血中含量的200倍。Paleyanda等将人凝血因子Ⅷ基因与乳腺表达载体相连接并导入猪，得到了在猪乳中表达人凝血因子Ⅷ的转基因猪。Rosengard 等[7]将人DAF（促衰变因子）基因导入猪的基因组并得到表达，用这种转基因猪的心脏移植给狒狒，成功克服了异种器官移植的超急性排斥反应。
在国内的研究始于20世纪80年代后期的国家“863”计划，中国农业大学陈永福教授与湖北省农业科学院畜牧兽医研究所魏庆信等人合作，1990年得到国内第1批转OMTPGH基因猪[8]。2000年，魏庆信等[9]报道hDAF转基因猪的制备获得成功。我国湖北省农业科学院郑新民等成功构建转人血清白蛋白基因猪，其血液中表达量高达 20 g/L 。赖良学博士[10]在美国密苏里大学与其他研究人员应用猪胚胎成纤维细胞系进行基因打靶，获得了敲除部分αGT（半乳糖苷转移酶）基因的克隆猪。特别是近年来，包括笔者所在实验室在内的一批研究机构成功构建多种转基因猪或基因敲除猪。
2 猪转基因常用方法的技术特点
目前，成功使用并获得转基因猪的方法主要有原核显微注射法、核移植转基因法、逆转录病毒载体法、精子载体法等。
2.1 原核显微注射法
受精卵原核注射法是最早应用于家畜的转基因方法[11]，最早建立的转基因猪技术是参照小鼠的原核注射法，该技术就是使用精细的显微注射针将外源基因直接注入猪受精卵的雄原核， 使外源基因整合到基因组， 从而获得转基因猪。用该方法制备转基因猪的优点是可以将较大片段的重组DNA注射到原核，获得的转基因动物能够有效地表达，其缺点是成本较高，转基因效率低，技术方面要求较高，注射的DNA整合到宿主基因组的效率低，得到转基因子代往往是嵌合体，需要花费大量的费用和时间筛选转基因个体，而且猪的受精卵含有大量的脂肪颗粒，在显微镜下较难看清原核。 2.2 体细胞核移植克隆法
体细胞核移植克隆法是目前转基因技术应用最广泛的方法，该技术是先将外源基因整合到供体细胞中，然后将供体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞，组成重构胚胎，再将其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩后即可得到转基因的克隆猪。虽然该技术既能借助各种基因转染手段制备转基因个体，也能借助靶向基因敲除技术获得基因敲除动物，但具有重组胚胎移植产仔率低、后代表型异常多发、制备成本高等缺点，筛选基因修饰细胞需要借助药物基因标记，难以达到无选择标记的基因转化，利用电转染或脂质体转染大片段DNA时往往只有部分序列嵌合至基因组，因此也不适合大片段转基因。
2.3 逆转录病毒法
逆转录病毒法的基本过程为：将目的基因重组到反转录病毒RNA 载体上，制成高滴度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可使胚胎与能释放反转录病毒的单培养层细胞共孵育以达到感染的目的。反转录病毒RNA 进入寄主细胞后，被反转录为DNA，并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下整合到寄主细胞的基因组进行表达和遗传，得到转基因动物。逆转录病毒法虽然操作简单，能有效将目的基因以单拷贝形式插入宿主，而且基因转移的效率较高，但基因插入是随机的，并且携带的DNA片段大小受限制，产生的后代大多为嵌合体，不容易建立ES细胞系。
2.4 精子载体法
精子载体法被认为是最简便的转基因方法。该方法只需将处理好的精子和外源DNA 共同孵育后，然后通过体外受精、人工授精转染到胚胎中，从而得到转基因猪个体。相关研究已有一些成功报道[12]，但其结果往往是外源基因只在PCR中被检测到，推测外源基因已被分解为不完整的片断。另外，从原理上分析，由于存在透明带、细胞膜等自然屏障，卵子允许精子带入不经降解的外源DNA的可能性极低。精子载体法由于试验结果难以重复，未能成为公认的可行途径。此外，体外人工授精生产猪体外胚胎的技术系统还有待完善，其中主要因素之一是多精受精的高发，由此降低了体外胚胎的发育率和移植受胎率。
3 单精子注射转基因法的特色优势
卵细胞胞质内单精子注射技术是20世纪80年代后期发展起来的一项新型人工辅助生殖技术，是借助显微操作系统，将单一精子注入成熟卵母细胞胞质内使其受精的技术，能使任意单一精子不经自然选择而完成受精。由于ICSI绕过了正常受精的所有过程，避开了自然受精过程中卵丘颗粒细胞，透明质酸细胞外基质（放射冠）和穿透卵透明带这三大屏障对精子的筛选作用，使ICSI具有受精率高和多精受精率低等优点[13-15] 。迄今为止，该项技术已在兔、牛、小鼠、马、猴、猪等动物和人类上获得成功[16]。由于ICSI法具有受精率高和多精受精率低，其受精率不受精子浓度、形态和活力的影响，在受精机理的研究、野生动物遗传资源保护、种质资源引进等领域具有广泛的应用价值。
利用ICSI技术将携带外源基因DNA的精子导入卵母细胞，是单精子注射法转基因（ICSISMGT）的基本原理。ICSISMGT法广义上也可称为精子载体法的一种，但其受精通过人为的精子注射完成，避开了自然受精的保护屏障，因而具有传统的精子载体转基因方法所无法比拟的优势。①对外源基因片段的长度限制少，不仅可以导入小片段DNA（<5 kb）而且还可以导入大片段DNA（11.9～170 kb）甚至细菌或人造染色体（BAC或MAC）[13-14，17-19]，适用范围与受精卵原核注射法相似，但显微注射法的难度低、效率更高；②单精子受精的精子不需要具有外部结构的完整性和运动能力，可通过各种理化处理促进与外源基因DNA的结合，提高基因导入效率；③精子和DNA的复合体直接输入卵细胞，不需要体外受精的孵育过程，排除了透明带和卵质膜对精子入卵的阻碍作用，外源基因受损的几率大大降低，有利于导入基因保持完整性；④基本排除多精入卵的可能性，受精率和胚胎正常发育率高，大大节约准备成熟猪卵母细胞核精子所付出的时间和成本。
将精子载体转基因法（SMGT）与单精注射（ICSI）结合制备转基因动物是一种新的转基因技术，研究历史较短，但其可行性和高效性已在多个物种中得到证实。1999年ICSI技术被首次应用于小鼠转基因[20]。2004年日本KOTO等[21]成功获得ICSI轉基因大鼠。作为一种新型的动物转基因技术，利用ICSI生产转基因动物在国际上获得了巨大成功，不仅可以获得整合小片段外源DNA的小鼠和大鼠，而且还可以生产分子量高达250 kb的细菌人工染色体（BAC）等人工染色体的转基因小鼠。2011年LIU等[22]将ICSI技术应用于青鳉鱼的转基因并获得了成功。
猪的ICSI研究起步较晚。Hosoi等[23]最早将猪活精子注入猪卵母细胞的包浆内观察到原核形成。Kim等[24]分别将猪的精子和精子头注入体内成熟卵母细胞内获得囊胚。2000年，Koo等[25]将精子与外源基因共孵育后通过ICSI注入猪体外成熟卵母细胞中获得转基因嵌合囊胚。Martin[26]采用体内成熟卵母细胞经ICSI首次获得存活的小猪。2003年，Michiko等[27]报道了体外成熟培养卵母细胞经ICSI获得3头健康小猪。2006年Kurome等[28]将精子与携带有人白蛋白（hALB）和绿色荧光蛋白（GFP）基因序列的DNA片段共孵育，用ICSI技术生产出1头表达hALB和GFP的转基因仔猪。2007年又通过对精子-外源基因DNA复合体制备方法进行改进，使ICSI法转基因胚胎的囊胚发育率、外源基因EGFP的表达阳性率大幅度提高，7头胚胎移植产仔中转基因个体有2头[29]。由此可见，ICSI显微技术与精子载体技术相结合为生产转基因动物开辟了一条简单易行的技术路线。
4 ICSI介导猪转基因技术的应用与展望
尽管家猪转基因技术已取得了较大进步，多种转基因猪表现出良好的产业化应用前景，但猪的转基因育种等应用研究还存在着诸多制约因素。例如，对家畜基因组的结构、功能和表达调控机制的研究尚不够深入，可选择利用的功效基因资源缺乏；转基因家畜生产效率低、成本高、周期长、通过大规模的转基因动物来筛选优良家系的花费巨大；外源基因的体内表达很难控制，容易偏离正常调控而丧失功能，或扰乱动物机体的生理平衡；对单个基因进行遗传操作，难以获得由多基因控制的数量性状的改良；人们对转基因动物的生物安全存在疑虑。这些问题的解决首先需要依靠功能基因组学基础研究的深入，更需要转基因技术本身的进步和成熟。 大片段转基因在转基因技术研发和转基因育种应用研究中具有重要的意义。只有能够导入大片段外源基因，才有可能改变目前转基因主要是cDNA而非基因组中自然序列的现状，也有希望通过附加更多基因上游或下游序列，实现转基因表达的精细、有效调控。因此，高效率导入大片段DNA的转基因是近年来转基因技术研究的一个重要方向。人工染色体（Artificial chromosome）介导的转基因是大片段转基因的典型例子，其为动物转基因技术展现了一个新的平台。
人工染色体是指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统，包括酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）、P1派生人工染色体（PAC）和哺乳动物人工染色体（MAC）等，通常用于基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析的工具。以细菌人工染色体（BACs）为例，BAC载体可以在1个单一克隆中包含完整的基因座位，包括编码区、内含子和调控区，而且具有克隆DNA能稳定复制、易分离、操作简单的特点。
以BAC作为转基因载体，由于BAC携带的基因包括上下游调控序列，可以与转录酶、转录因子等作用，转基因将能遵守基因固有的表达机制[30-31]。另外，导入的外源序列在受体基因组中营造一种相对独立的环境，消除或减少染色体位置效应的影响，可以最大程度地保持基因本身的表达时空调控特征。因此，利用BAC转基因已经成为小鼠上对候选基因直接进行功能研究的有力手段。同时，在动物生物反应器研制中，利用BAC转基因较采用短片段的组织特异性启动子更容易实现外源基因在特定部位的高水平表达。1999年Stinnakre等[32]将克隆有山羊α乳清蛋白及其两侧非编码区的BAC DNA片段显微注射到小鼠受精卵原核，获得了高浓度乳腺特异表达的转基因小鼠。此外，目前的BAC载体可以通过α互补原理替换内含基因的蛋白编码序列，用来表达其他目的基因。依靠载体骨架两端的稀少型限制酶切位点（例如NotⅠ），可以将基因表达单元的长片段克隆DNA回收用于转基因，因而能够避免载体中附带的药物筛选基因等序列进入动物基因组。
小鼠BAC转染主要利用受精卵原核注射方法，而猪受精卵内分布大量脂滴，造成原核可视性极差，难以采用原核注射法进行转基因操作，使大片段DNA的基因转导缺乏有效技术手段，而ICSI介导的转基因有望解决猪转基因的难题。2012年日本明治大学长嶋教授研究组[33]利用ICSI方法进行猪BAC转基因研究获得成功，开创了国际上猪ICSIBAC转基因的先例。ICSI技术与BAC转基因技术相结合制备转基因猪，为今后制备大片段转基因猪提供了新方法，相信该技术必定会受到越来越多的关注，并被广泛研究与应用，成为今后转基因猪研究的优选技术途径。
42卷8期 胡骁睿等 胞质内单精子注射制备转基因猪技术的优势与前景
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关键词 转基因；单精注射；人工染色体；猪胚胎
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02337-03
The Advantages and Prospect of Producing Transgenic Porcine by Intracytoplasmic Sperm Injection
HU Xiaorui， PAN Jianzhi et al
（Zhejiang Normal University， Jinhua， Zhejiang 321004； Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou， Zhejiang 310021）
Abstract The review was about the development of transgenic porcine in the last two decades. And the characteristics of different kinds of transgenic methods are discussed. This paper expounds the advantages of Intracytoplasmic Sperm Injection（ICSI） in producing transgenic porcine， and describes the application of producing large fragments of transgenic pigs by ICSI combined with artificial chromosome vectors technology.
Key words Transfer genes； ICSI； Artificial chromosome vectors； Pig embryo
猪的转基因技术研究具有重要的理论和商业价值[1]。利用猪的转基因技术能在较短时间内提高猪的生产性能和抗病能力，加快动物改良进程，培育出新的品种或种群；可用于研究未知基因的功能和关键基因的表达调控特点；也可作为生物反应器，还可为人异种器官移植提供供体等[2]。从技术角度来看，准备转基因胚胎是制作转基因猪的基础，因为外源基因导入的载体或途径不同，形成了各具特色和功效的转基因技术[3]。其中，以精子为载体的方法统称为精子介导转基因技术（Spermmediated gene Transfer，SMGT），受精过程的控制对于精子能否将外源基因携带进入成熟卵子，进而整合至受精卵基因组，是决定制备转基因胚胎成败的关键。笔者对卵细胞胞质内单精子注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技术在猪转基因中的应用进行了分析，以加深对这种转基因方法的优势和应用前景的了解。
1 转基因猪研究概况
猪既是重要的经济动物，也是人类医学研究的一个重要模型动物，因为从自然特性来看，其在解剖、组织、生理和营养代谢等方面与人类略接近。因此，无论从农业科技的角度还是人类医疗、基础研究等方面，各国学者对转基因猪的研究均极为重视。自1985年Hammer等得到第1批转基因猪以来，有关转基因猪的研究已有20多年的历史。对猪生产性能的遗传改良、作为生物反应器生产医用蛋白以及作为异种器官移植的供体等方面都取得了一系列重要的进展。
在国外，Lo等[4]将小鼠抗磷酰胆碱（PC）抗体的α+κ链融合基因注入猪的受精卵，获得的转基因猪中产生的单克隆抗体已被证实具有抗病活性。Brem等将小鼠抗流感基因导入猪的基因组，得到的转基因猪增强了对流感病毒的抵抗力。日本近畿大学入谷明教授等将菠菜 FAD12基因植入猪的受精卵中，成功培育出比普通猪不饱和脂肪酸含量高20%的转基因猪。Lai等[5]将取自秀丽线虫的FAT1基因导入猪的基因组，然后借助克隆技术培育出富含ω3脂肪酸的转基因猪。美国弗吉尼亚大学Willam等[6]成功构建了在乳腺中特异表达人蛋白C的转基因猪，其表达量是正常人血中含量的200倍。Paleyanda等将人凝血因子Ⅷ基因与乳腺表达载体相连接并导入猪，得到了在猪乳中表达人凝血因子Ⅷ的转基因猪。Rosengard 等[7]将人DAF（促衰变因子）基因导入猪的基因组并得到表达，用这种转基因猪的心脏移植给狒狒，成功克服了异种器官移植的超急性排斥反应。
在国内的研究始于20世纪80年代后期的国家“863”计划，中国农业大学陈永福教授与湖北省农业科学院畜牧兽医研究所魏庆信等人合作，1990年得到国内第1批转OMTPGH基因猪[8]。2000年，魏庆信等[9]报道hDAF转基因猪的制备获得成功。我国湖北省农业科学院郑新民等成功构建转人血清白蛋白基因猪，其血液中表达量高达 20 g/L 。赖良学博士[10]在美国密苏里大学与其他研究人员应用猪胚胎成纤维细胞系进行基因打靶，获得了敲除部分αGT（半乳糖苷转移酶）基因的克隆猪。特别是近年来，包括笔者所在实验室在内的一批研究机构成功构建多种转基因猪或基因敲除猪。
2 猪转基因常用方法的技术特点
目前，成功使用并获得转基因猪的方法主要有原核显微注射法、核移植转基因法、逆转录病毒载体法、精子载体法等。
2.1 原核显微注射法
受精卵原核注射法是最早应用于家畜的转基因方法[11]，最早建立的转基因猪技术是参照小鼠的原核注射法，该技术就是使用精细的显微注射针将外源基因直接注入猪受精卵的雄原核， 使外源基因整合到基因组， 从而获得转基因猪。用该方法制备转基因猪的优点是可以将较大片段的重组DNA注射到原核，获得的转基因动物能够有效地表达，其缺点是成本较高，转基因效率低，技术方面要求较高，注射的DNA整合到宿主基因组的效率低，得到转基因子代往往是嵌合体，需要花费大量的费用和时间筛选转基因个体，而且猪的受精卵含有大量的脂肪颗粒，在显微镜下较难看清原核。 2.2 体细胞核移植克隆法
体细胞核移植克隆法是目前转基因技术应用最广泛的方法，该技术是先将外源基因整合到供体细胞中，然后将供体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞，组成重构胚胎，再将其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩后即可得到转基因的克隆猪。虽然该技术既能借助各种基因转染手段制备转基因个体，也能借助靶向基因敲除技术获得基因敲除动物，但具有重组胚胎移植产仔率低、后代表型异常多发、制备成本高等缺点，筛选基因修饰细胞需要借助药物基因标记，难以达到无选择标记的基因转化，利用电转染或脂质体转染大片段DNA时往往只有部分序列嵌合至基因组，因此也不适合大片段转基因。
2.3 逆转录病毒法
逆转录病毒法的基本过程为：将目的基因重组到反转录病毒RNA 载体上，制成高滴度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可使胚胎与能释放反转录病毒的单培养层细胞共孵育以达到感染的目的。反转录病毒RNA 进入寄主细胞后，被反转录为DNA，并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下整合到寄主细胞的基因组进行表达和遗传，得到转基因动物。逆转录病毒法虽然操作简单，能有效将目的基因以单拷贝形式插入宿主，而且基因转移的效率较高，但基因插入是随机的，并且携带的DNA片段大小受限制，产生的后代大多为嵌合体，不容易建立ES细胞系。
2.4 精子载体法
精子载体法被认为是最简便的转基因方法。该方法只需将处理好的精子和外源DNA 共同孵育后，然后通过体外受精、人工授精转染到胚胎中，从而得到转基因猪个体。相关研究已有一些成功报道[12]，但其结果往往是外源基因只在PCR中被检测到，推测外源基因已被分解为不完整的片断。另外，从原理上分析，由于存在透明带、细胞膜等自然屏障，卵子允许精子带入不经降解的外源DNA的可能性极低。精子载体法由于试验结果难以重复，未能成为公认的可行途径。此外，体外人工授精生产猪体外胚胎的技术系统还有待完善，其中主要因素之一是多精受精的高发，由此降低了体外胚胎的发育率和移植受胎率。
3 单精子注射转基因法的特色优势
卵细胞胞质内单精子注射技术是20世纪80年代后期发展起来的一项新型人工辅助生殖技术，是借助显微操作系统，将单一精子注入成熟卵母细胞胞质内使其受精的技术，能使任意单一精子不经自然选择而完成受精。由于ICSI绕过了正常受精的所有过程，避开了自然受精过程中卵丘颗粒细胞，透明质酸细胞外基质（放射冠）和穿透卵透明带这三大屏障对精子的筛选作用，使ICSI具有受精率高和多精受精率低等优点[13-15] 。迄今为止，该项技术已在兔、牛、小鼠、马、猴、猪等动物和人类上获得成功[16]。由于ICSI法具有受精率高和多精受精率低，其受精率不受精子浓度、形态和活力的影响，在受精机理的研究、野生动物遗传资源保护、种质资源引进等领域具有广泛的应用价值。
利用ICSI技术将携带外源基因DNA的精子导入卵母细胞，是单精子注射法转基因（ICSISMGT）的基本原理。ICSISMGT法广义上也可称为精子载体法的一种，但其受精通过人为的精子注射完成，避开了自然受精的保护屏障，因而具有传统的精子载体转基因方法所无法比拟的优势。①对外源基因片段的长度限制少，不仅可以导入小片段DNA（<5 kb）而且还可以导入大片段DNA（11.9～170 kb）甚至细菌或人造染色体（BAC或MAC）[13-14，17-19]，适用范围与受精卵原核注射法相似，但显微注射法的难度低、效率更高；②单精子受精的精子不需要具有外部结构的完整性和运动能力，可通过各种理化处理促进与外源基因DNA的结合，提高基因导入效率；③精子和DNA的复合体直接输入卵细胞，不需要体外受精的孵育过程，排除了透明带和卵质膜对精子入卵的阻碍作用，外源基因受损的几率大大降低，有利于导入基因保持完整性；④基本排除多精入卵的可能性，受精率和胚胎正常发育率高，大大节约准备成熟猪卵母细胞核精子所付出的时间和成本。
将精子载体转基因法（SMGT）与单精注射（ICSI）结合制备转基因动物是一种新的转基因技术，研究历史较短，但其可行性和高效性已在多个物种中得到证实。1999年ICSI技术被首次应用于小鼠转基因[20]。2004年日本KOTO等[21]成功获得ICSI轉基因大鼠。作为一种新型的动物转基因技术，利用ICSI生产转基因动物在国际上获得了巨大成功，不仅可以获得整合小片段外源DNA的小鼠和大鼠，而且还可以生产分子量高达250 kb的细菌人工染色体（BAC）等人工染色体的转基因小鼠。2011年LIU等[22]将ICSI技术应用于青鳉鱼的转基因并获得了成功。
猪的ICSI研究起步较晚。Hosoi等[23]最早将猪活精子注入猪卵母细胞的包浆内观察到原核形成。Kim等[24]分别将猪的精子和精子头注入体内成熟卵母细胞内获得囊胚。2000年，Koo等[25]将精子与外源基因共孵育后通过ICSI注入猪体外成熟卵母细胞中获得转基因嵌合囊胚。Martin[26]采用体内成熟卵母细胞经ICSI首次获得存活的小猪。2003年，Michiko等[27]报道了体外成熟培养卵母细胞经ICSI获得3头健康小猪。2006年Kurome等[28]将精子与携带有人白蛋白（hALB）和绿色荧光蛋白（GFP）基因序列的DNA片段共孵育，用ICSI技术生产出1头表达hALB和GFP的转基因仔猪。2007年又通过对精子-外源基因DNA复合体制备方法进行改进，使ICSI法转基因胚胎的囊胚发育率、外源基因EGFP的表达阳性率大幅度提高，7头胚胎移植产仔中转基因个体有2头[29]。由此可见，ICSI显微技术与精子载体技术相结合为生产转基因动物开辟了一条简单易行的技术路线。
4 ICSI介导猪转基因技术的应用与展望
尽管家猪转基因技术已取得了较大进步，多种转基因猪表现出良好的产业化应用前景，但猪的转基因育种等应用研究还存在着诸多制约因素。例如，对家畜基因组的结构、功能和表达调控机制的研究尚不够深入，可选择利用的功效基因资源缺乏；转基因家畜生产效率低、成本高、周期长、通过大规模的转基因动物来筛选优良家系的花费巨大；外源基因的体内表达很难控制，容易偏离正常调控而丧失功能，或扰乱动物机体的生理平衡；对单个基因进行遗传操作，难以获得由多基因控制的数量性状的改良；人们对转基因动物的生物安全存在疑虑。这些问题的解决首先需要依靠功能基因组学基础研究的深入，更需要转基因技术本身的进步和成熟。 大片段转基因在转基因技术研发和转基因育种应用研究中具有重要的意义。只有能够导入大片段外源基因，才有可能改变目前转基因主要是cDNA而非基因组中自然序列的现状，也有希望通过附加更多基因上游或下游序列，实现转基因表达的精细、有效调控。因此，高效率导入大片段DNA的转基因是近年来转基因技术研究的一个重要方向。人工染色体（Artificial chromosome）介导的转基因是大片段转基因的典型例子，其为动物转基因技术展现了一个新的平台。
人工染色体是指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统，包括酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）、P1派生人工染色体（PAC）和哺乳动物人工染色体（MAC）等，通常用于基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析的工具。以细菌人工染色体（BACs）为例，BAC载体可以在1个单一克隆中包含完整的基因座位，包括编码区、内含子和调控区，而且具有克隆DNA能稳定复制、易分离、操作简单的特点。
以BAC作为转基因载体，由于BAC携带的基因包括上下游调控序列，可以与转录酶、转录因子等作用，转基因将能遵守基因固有的表达机制[30-31]。另外，导入的外源序列在受体基因组中营造一种相对独立的环境，消除或减少染色体位置效应的影响，可以最大程度地保持基因本身的表达时空调控特征。因此，利用BAC转基因已经成为小鼠上对候选基因直接进行功能研究的有力手段。同时，在动物生物反应器研制中，利用BAC转基因较采用短片段的组织特异性启动子更容易实现外源基因在特定部位的高水平表达。1999年Stinnakre等[32]将克隆有山羊α乳清蛋白及其两侧非编码区的BAC DNA片段显微注射到小鼠受精卵原核，获得了高浓度乳腺特异表达的转基因小鼠。此外，目前的BAC载体可以通过α互补原理替换内含基因的蛋白编码序列，用来表达其他目的基因。依靠载体骨架两端的稀少型限制酶切位点（例如NotⅠ），可以将基因表达单元的长片段克隆DNA回收用于转基因，因而能够避免载体中附带的药物筛选基因等序列进入动物基因组。
小鼠BAC转染主要利用受精卵原核注射方法，而猪受精卵内分布大量脂滴，造成原核可视性极差，难以采用原核注射法进行转基因操作，使大片段DNA的基因转导缺乏有效技术手段，而ICSI介导的转基因有望解决猪转基因的难题。2012年日本明治大学长嶋教授研究组[33]利用ICSI方法进行猪BAC转基因研究获得成功，开创了国际上猪ICSIBAC转基因的先例。ICSI技术与BAC转基因技术相结合制备转基因猪，为今后制备大片段转基因猪提供了新方法，相信该技术必定会受到越来越多的关注，并被广泛研究与应用，成为今后转基因猪研究的优选技术途径。
42卷8期 胡骁睿等 胞质内单精子注射制备转基因猪技术的优势与前景
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