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【摘 要】 目的：建立测定淫羊藿根中朝藿定C的含量测定方法。方法：采用安捷伦Eclipse Plus C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相為乙腈-水（25∶[KG-*3/5]75），等度洗脱，流速1mL/min，检测波长270nm。结果：朝藿定C在0.973～9.729μg内呈良好的线性关系，r=1.0000，方法重复性、精密度等均满足分析要求，方法回收率为102.3%，RSD为0.7%。结论：该方法测定淫羊藿根中朝藿定C的含量，结果准确，重复性、稳定性较好。
【关键词】 淫羊藿根；朝藿定C；高效液相色谱；含量测定
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）16-0017-03
淫羊藿根为小檗科植物箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum （Sieb. Et Zucc.） Maxim、巫山淫羊藿Epimedium wushanenese T.S.Ying、天平山淫羊藿Epimedium myrianthum Steam、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim、毡毛淫羊藿Epimedium coactum H.R.Liang et W.M.Yan、粗毛淫羊藿Epimedium acuminatum Franch及光叶淫羊藿Epimedium sagittatum var. glabratum T.S.Ying的干燥根。具有补肾壮阳、祛风除湿的功效，用于肾虚阳痿、小便淋漓、咳喘、风湿痹痛[1]。淫羊藿含有多种有效成分，其主要有效成分为淫羊藿苷类黄酮化合物[2]，而其中的朝藿定C具有抗骨质疏松、抗癌、免疫增加等广泛的药理活性[3-4]。课题前期进行的预实验结果显示，朝藿定C的含量远高于淫羊藿苷等其他类黄酮化合物，适宜定量分析。故选择朝藿定C作为定量指标用于淫羊藿根药材的质量控制。本文用反相液相色谱测定了11种贵州地产药材淫羊藿根中朝藿定C的含量，可为淫羊藿根质量控制及相关医药产业提供理论根据参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器 美国安捷伦1260高效液相色谱仪，上海科导SK250LHC超声波清洗器，瑞士梅特勒托利多AG135和AL204电子天平，北京普析TU-1901紫外分光光度计。
1.2 材料 朝藿定C对照品（含量95.5%，批号：111780-201503，中国药品生物制品检定所）；乙腈（色谱纯，批号：20170403，天津科密欧）；95%乙醇（分析纯，批号：20161105，天津科密欧）；纯净水（批号：20171201，娃哈哈）；淫羊藿根样品分别采集自贵州各地共11批（采集信息见表1），样品均经贵阳中医学院何顺志教授鉴定。样品洗净后晒干，粉碎，过三号筛，即得供试样品，置于干燥器中保存。
2 方法与结果
2.1 色谱条件[5-6] 色谱柱：美国安捷伦Eclipse Plus C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-水（25∶[KG-*3/5]75）；流速：1.0mL/min，进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长270nm。理论板数以朝藿定C峰计算均不低于6000。
2.2 对照品溶液配制 精密称取朝藿定C对照品50.94mg置50mL量瓶中，加50%乙醇超声溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液5mL置20mL量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，即得（0.243mg/mL）。
2.3 供试品溶液配制[5-6] 取供试样品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，称定重量，放置过夜，超声60分钟（50kHz），放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，经0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 峰纯度考察 取对照品溶液、供试品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，按2.1项下的色谱条件，依法测定。朝藿定C峰的紫外扫描光谱表明：朝藿定C对照品的紫外扫描图在200nm、270nm和320nm处有最大吸收。3D图谱显示：200nm波长处吸收大但杂质干扰较多，320nm波长处干扰少但吸收较小，270nm波长处吸收值较大且干扰少。供试品溶液中朝藿定C峰的紫外扫描图与对照品峰的紫外扫描图谱一致，且纯度因子达到999以上。综合以上考察，确定检测波长为270nm。
2.5 线性关系考察 精密量取2.2项下对照品贮备液1、2、4、6、8mL分别置10mL量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，得一系列浓度级别的对照品溶液；精密吸取上述系列对照品溶液和对照品贮备液各10μL，分别注入液相色谱仪，按2.1项下的色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度（mg/mL）为横坐标，进行线性回归计算，朝藿定C回归方程为：y=18219.1343x+26.8045，r=1.0000，结果表明朝藿定C在0.0973～0.9730mg范围内呈良好的线性关系。
2.6 精密度考察 精密吸取2.2项下朝藿定C对照品溶液10μL，按2.1项下的色谱条件，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积，朝藿定C峰面积的RSD为0.14%，结果表明方法有良好的精密度。
2.7 稳定性考察 取同一供试品溶液分别于0、5、11、18h进样，进样量10μL，按2.1项下的色谱条件，测定朝藿定C峰面积，RSD为0.6%，表明供试品溶液在18h内稳定性良好。[JP]
2.8 [JP2]重复性考察 称取同一供试品6份，按2.3项下方法配制供试品溶液，按2.1项下的色谱条件，进样量10μL，测定峰面积，计算含量。供试品中朝藿定C的平均含量为2.611%，RSD为0.4%，表明本方法重复性良好，符合定量标准要求。[JP]
2.9 加样回收率试验 精密称取8份已测定含量的样品0.1g（朝藿定C含量为2.611%），分别置具塞锥形瓶中，精密加入回收对照溶液20mL，称定重量，放置过夜，超声60min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm滤膜滤过，取续滤液，按2.1项下的色谱条件，进样10μL，记录色谱图，计算回收率。朝藿定C的平均回收率为102.3%，RSD为0.7%，表明本方法准确度良好，符合相关规定。结果见表2。 2.10 样品含量测定 取不同产地供试样品按2.3配制供试品溶液，分别进样10μL，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。结果见表3。
3 讨论
为获得准确的含量测定结果，本研究考察了浸泡过夜、浸泡过夜后超声、浸泡过夜后水浴回流、浸泡过夜后超声再水浴回流等四种不同的提取方法，结果表明，浸泡过夜后超声效果为最佳，增加水浴回流步骤反而使朝藿定C含量结果降低。文献报道[7]，朝藿定C（三糖苷）在高温环境下会脱去一个鼠李糖后转化为淫羊藿苷（二糖苷），导致朝藿定C含量下降、淫羊藿苷含量升高。因此选择浸泡过夜后超声作为本实验的提取方式。
实验中有3个样本分别为黔岭淫羊藿和水城淫羊藿，不在贵州省淫羊藿根药材标准收载的品种中，但作为贵州特有品种，本研究也对这3个样本进行了含量测定，朝藿定C含量最低为0.86%，而标准收载的品种中，朝藿定C含量最低为0.89%。结果显示，非标准品种中朝藿定C的含量也可以达到标准品种的含量水平，建议修订淫羊藿根标准时增加收载品种，扩大贵州省淫羊藿根来源的覆盖范围。
淫羊藿根作为贵州省少数民族常用药材，收载于《贵州省中药材民族药材质量标准》中，但标准中仅有一项性状描述，不能有效控制药材的质量。已有文献研究对象多为淫羊藿药材，按《中国药典》一部定义为淫羊藿的干燥叶[8]。淫羊藿植株入药部位不同，有效成份含量也有所差异，本研究可为淫羊藿根药材的标准制定、医疗应用和质量控制提供数据参考。
参考文献
[1]贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[S].贵阳：贵州科技出版社，2003：350.
[2]谢娟平，孙文基.淫羊藿属植物化学成分及药理研究进展[J].海峡药学，2006，18（5）：17-20.
[3]蔡曼玲，季晖，李萍，等.5种淫羊藿黄酮类成分对体外培养成骨细胞的影响[J].中国天然药物，2004，2（4）：235-238.
[4]Liang H R. Vuorela P. Vuorela H. et al.Isolation and immunomodulatory effect of flavonol glycosides from Epimedium hunanense [J]. Planta Medica， 1997（63）：316-319.
[5]徐文芬，杨雯，何顺志，等.一测多评法测定淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定A、B、C [J].中草药，2016，47（1）：130-137.
[6]徐文芬，何顺志，黄敏，等.高效液相色谱法测定贵州产淫羊藿药材不同药用部位中淫羊藿苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2007，13（5）：1-3.
[7]孫娥，陈玲玲，贾晓斌，等.药材品种与受热时间对淫羊藿饮片中主要黄酮类成分的影响规律研究[J].中药材，2012，35（9）：1402-1407.
[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：327.
（收稿日期：2018-06-07 编辑：程鹏飞）
【关键词】 淫羊藿根；朝藿定C；高效液相色谱；含量测定
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）16-0017-03
淫羊藿根为小檗科植物箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum （Sieb. Et Zucc.） Maxim、巫山淫羊藿Epimedium wushanenese T.S.Ying、天平山淫羊藿Epimedium myrianthum Steam、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim、毡毛淫羊藿Epimedium coactum H.R.Liang et W.M.Yan、粗毛淫羊藿Epimedium acuminatum Franch及光叶淫羊藿Epimedium sagittatum var. glabratum T.S.Ying的干燥根。具有补肾壮阳、祛风除湿的功效，用于肾虚阳痿、小便淋漓、咳喘、风湿痹痛[1]。淫羊藿含有多种有效成分，其主要有效成分为淫羊藿苷类黄酮化合物[2]，而其中的朝藿定C具有抗骨质疏松、抗癌、免疫增加等广泛的药理活性[3-4]。课题前期进行的预实验结果显示，朝藿定C的含量远高于淫羊藿苷等其他类黄酮化合物，适宜定量分析。故选择朝藿定C作为定量指标用于淫羊藿根药材的质量控制。本文用反相液相色谱测定了11种贵州地产药材淫羊藿根中朝藿定C的含量，可为淫羊藿根质量控制及相关医药产业提供理论根据参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器 美国安捷伦1260高效液相色谱仪，上海科导SK250LHC超声波清洗器，瑞士梅特勒托利多AG135和AL204电子天平，北京普析TU-1901紫外分光光度计。
1.2 材料 朝藿定C对照品（含量95.5%，批号：111780-201503，中国药品生物制品检定所）；乙腈（色谱纯，批号：20170403，天津科密欧）；95%乙醇（分析纯，批号：20161105，天津科密欧）；纯净水（批号：20171201，娃哈哈）；淫羊藿根样品分别采集自贵州各地共11批（采集信息见表1），样品均经贵阳中医学院何顺志教授鉴定。样品洗净后晒干，粉碎，过三号筛，即得供试样品，置于干燥器中保存。
2 方法与结果
2.1 色谱条件[5-6] 色谱柱：美国安捷伦Eclipse Plus C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-水（25∶[KG-*3/5]75）；流速：1.0mL/min，进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长270nm。理论板数以朝藿定C峰计算均不低于6000。
2.2 对照品溶液配制 精密称取朝藿定C对照品50.94mg置50mL量瓶中，加50%乙醇超声溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液5mL置20mL量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，即得（0.243mg/mL）。
2.3 供试品溶液配制[5-6] 取供试样品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，称定重量，放置过夜，超声60分钟（50kHz），放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，经0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 峰纯度考察 取对照品溶液、供试品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，按2.1项下的色谱条件，依法测定。朝藿定C峰的紫外扫描光谱表明：朝藿定C对照品的紫外扫描图在200nm、270nm和320nm处有最大吸收。3D图谱显示：200nm波长处吸收大但杂质干扰较多，320nm波长处干扰少但吸收较小，270nm波长处吸收值较大且干扰少。供试品溶液中朝藿定C峰的紫外扫描图与对照品峰的紫外扫描图谱一致，且纯度因子达到999以上。综合以上考察，确定检测波长为270nm。
2.5 线性关系考察 精密量取2.2项下对照品贮备液1、2、4、6、8mL分别置10mL量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，得一系列浓度级别的对照品溶液；精密吸取上述系列对照品溶液和对照品贮备液各10μL，分别注入液相色谱仪，按2.1项下的色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度（mg/mL）为横坐标，进行线性回归计算，朝藿定C回归方程为：y=18219.1343x+26.8045，r=1.0000，结果表明朝藿定C在0.0973～0.9730mg范围内呈良好的线性关系。
2.6 精密度考察 精密吸取2.2项下朝藿定C对照品溶液10μL，按2.1项下的色谱条件，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积，朝藿定C峰面积的RSD为0.14%，结果表明方法有良好的精密度。
2.7 稳定性考察 取同一供试品溶液分别于0、5、11、18h进样，进样量10μL，按2.1项下的色谱条件，测定朝藿定C峰面积，RSD为0.6%，表明供试品溶液在18h内稳定性良好。[JP]
2.8 [JP2]重复性考察 称取同一供试品6份，按2.3项下方法配制供试品溶液，按2.1项下的色谱条件，进样量10μL，测定峰面积，计算含量。供试品中朝藿定C的平均含量为2.611%，RSD为0.4%，表明本方法重复性良好，符合定量标准要求。[JP]
2.9 加样回收率试验 精密称取8份已测定含量的样品0.1g（朝藿定C含量为2.611%），分别置具塞锥形瓶中，精密加入回收对照溶液20mL，称定重量，放置过夜，超声60min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm滤膜滤过，取续滤液，按2.1项下的色谱条件，进样10μL，记录色谱图，计算回收率。朝藿定C的平均回收率为102.3%，RSD为0.7%，表明本方法准确度良好，符合相关规定。结果见表2。 2.10 样品含量测定 取不同产地供试样品按2.3配制供试品溶液，分别进样10μL，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。结果见表3。
3 讨论
为获得准确的含量测定结果，本研究考察了浸泡过夜、浸泡过夜后超声、浸泡过夜后水浴回流、浸泡过夜后超声再水浴回流等四种不同的提取方法，结果表明，浸泡过夜后超声效果为最佳，增加水浴回流步骤反而使朝藿定C含量结果降低。文献报道[7]，朝藿定C（三糖苷）在高温环境下会脱去一个鼠李糖后转化为淫羊藿苷（二糖苷），导致朝藿定C含量下降、淫羊藿苷含量升高。因此选择浸泡过夜后超声作为本实验的提取方式。
实验中有3个样本分别为黔岭淫羊藿和水城淫羊藿，不在贵州省淫羊藿根药材标准收载的品种中，但作为贵州特有品种，本研究也对这3个样本进行了含量测定，朝藿定C含量最低为0.86%，而标准收载的品种中，朝藿定C含量最低为0.89%。结果显示，非标准品种中朝藿定C的含量也可以达到标准品种的含量水平，建议修订淫羊藿根标准时增加收载品种，扩大贵州省淫羊藿根来源的覆盖范围。
淫羊藿根作为贵州省少数民族常用药材，收载于《贵州省中药材民族药材质量标准》中，但标准中仅有一项性状描述，不能有效控制药材的质量。已有文献研究对象多为淫羊藿药材，按《中国药典》一部定义为淫羊藿的干燥叶[8]。淫羊藿植株入药部位不同，有效成份含量也有所差异，本研究可为淫羊藿根药材的标准制定、医疗应用和质量控制提供数据参考。
参考文献
[1]贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[S].贵阳：贵州科技出版社，2003：350.
[2]谢娟平，孙文基.淫羊藿属植物化学成分及药理研究进展[J].海峡药学，2006，18（5）：17-20.
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[4]Liang H R. Vuorela P. Vuorela H. et al.Isolation and immunomodulatory effect of flavonol glycosides from Epimedium hunanense [J]. Planta Medica， 1997（63）：316-319.
[5]徐文芬，杨雯，何顺志，等.一测多评法测定淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定A、B、C [J].中草药，2016，47（1）：130-137.
[6]徐文芬，何顺志，黄敏，等.高效液相色谱法测定贵州产淫羊藿药材不同药用部位中淫羊藿苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2007，13（5）：1-3.
[7]孫娥，陈玲玲，贾晓斌，等.药材品种与受热时间对淫羊藿饮片中主要黄酮类成分的影响规律研究[J].中药材，2012，35（9）：1402-1407.
[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：327.
（收稿日期：2018-06-07 编辑：程鹏飞）