论文部分内容阅读
摘要：近年来，在山东省临沭县、昌乐县、章丘县等地西瓜育苗基地的西瓜苗上发现了一种新病害——西瓜细菌性果斑病。从病果和病叶片上分离到15个细菌菌株，选取8个菌株进行致病性测定，结果表明，该8个菌株均能侵染西瓜，发病症状和自然发病症状完全一致；从接种发病的病果上可重新分离到相同的细菌。对该8个菌株菌体形态、染色反应、培养性状及其生理生化特性等项目进行观察测定，确认供试菌株为燕麦食酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992）。
关键词：西瓜；细菌性果斑病；病原鉴定
中图分类号：S432.4+2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）03-0083-03
AbstractIn recent years， watermelon had been attacked by a new bacterial disease called bacterial fruit blotch （BFB） in some planting areas of Shandong Province， including Linshu， Changle and Zhangqiu. Fifteen strains were isolated from diseased fruits and leaves of watermelon. The inoculation tests were conducted with 8 strains， which produced the same symptoms as naturally infected plants. And the same strains were isolated from inoculated watermelon. Based on the mycelial morphology， staining reaction， cultural characteristics and a series of physiological and biochemical properties， the pathogens were identified as Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992.
Key wordsWatermelon； Bacterial fruit blotch； Pathogen identification
自2009年始，山东省临沭县、昌乐县、章丘市等西瓜育苗基地西瓜普遍发生一种细菌性病害，发病程度轻重不等，如临沭县西瓜育苗基地所育26万株西瓜苗全部封埋销毁，造成极大损失。2010～2013年笔者在章丘西瓜育苗基地抽检的西瓜苗上同样分离到该种细菌，根据病害症状推测是Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems， Goor ， Thieiemans， Gillis， Kersters & Ley。因此，有必要对该细菌性病害的病原菌进行系统鉴定来加以确认，为该病害的防治提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试材料2009年从山东省临沭县大棚采集的双星、京欣、极品京欣西瓜病果。对照菌株为燕麦食酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp.
citrulli Willems et al.，1992），由山东农业大学植保学院植物病理学系提供。
1.1.2培养基NA培养基为分离培养基，KB培养基用于观察荧光反应[3]。
1.2试验方法
1.2.1病原菌分离、纯化取病组织，用灭菌剖解刀切取病健交界处组织，75%酒精消毒2 s，移至0.1%升汞液消毒1～2 min，经灭菌水冲洗后置于小瓷皿中研磨，加无菌水浸20 min，然后用移菌环蘸取组织液在NA培养基划线，28℃培养48 h，长出单菌落后在NA培养基再划线，使细菌纯化。纯化后的各菌株编号保存冰箱中备用。
1.2.2马铃薯软腐将马铃薯洗净用75%酒精表面消毒，切成5 mm厚的薯片，在无菌操作下放在无菌培养皿中。将在NA培养基上培养24 h的供试菌株用移菌环接在块茎上，28℃条件下培养48 h后，观察马铃薯软腐情况。
1.2.3病原菌的致病测定8个菌株与对照菌株在28℃条件下培养24 h，配成3×108个/ml菌悬液，喷雾和刺伤接种于健康西瓜幼苗4～6叶和果实，同时以接清水为对照（CK）。在28℃下保湿48 h，之后白天光照，晚上保湿，每天注意观察发病情况。
1.2.4细菌学性状细菌的格兰氏染色、形态特征、培养性状、生理生化测定等，主要参照《植病研究方法》[3]、《一般细菌常用鉴定方法》[7]、《常见细菌系统鉴定手册》[2]等方法进行。
2结果与分析
2.1病害症状
西瓜果斑病田间可危害西瓜幼苗子叶、定植后的西瓜叶片（子叶及真叶）和果实（幼果和成熟果）。定植前幼苗发病，叶尖或叶缘出现水渍状小斑点，逐渐向子叶基部扩展为条形或不规则形暗绿色水渍状斑点，沿中脉变黑。真叶受害开始为水渍状小斑点，逐渐扩大成为多角形（因受叶脉限制）或不规则形褪绿病斑，随病情的发展，病斑逐步变为褐色，干枯下陷。西瓜果实发病后，初期在西瓜表面出现水渍状小斑点，随病情发展，病斑逐渐扩展为圆形或不规则形的大型暗绿色斑块，病斑处有大量乳白色菌液溢出，后期病斑变成褐色，并多处开裂，将西瓜剖开，西瓜果肉腐烂，出现“水瓤瓜”现象，最后引起整个果实腐烂。
2.2病原菌分离
通过分离纯化共获得8个菌株用于致病性测定和病原菌的鉴定。 2.3致病性测定
8个菌株致病性测定都表现出与田间病害症状相同的典型症状。接种发病后的病斑经再分离，其菌落性状和初分离时一致。
2.4细菌学性状鉴定
2.4.1细菌的形态及染色反应供试8个菌株格兰氏染色均呈阳性反应，菌体呈杆状，两端钝圆，大小为（2～3）mm×（0.50～0.51）mm，不产生芽孢和荚膜，单根极生鞭毛（图1）。
2.4.2病原菌培养性状供试菌株在KB培养基上28～30℃下培养48 h，菌落呈乳白色，较小、圆形、隆起、有光泽、表面光滑、不透明、无黄色、不产荧光。最适生长温度为24～30℃，41℃能生长。
2.4.3病原菌生理生化性状测定从表1可知，8个供试菌株与对照菌株测试结果一致，都不能在KB培养基产生荧光，不产生果聚糖，（氧化）精氨酸双水解酶阴性，不能产生吲哚，不能水解淀粉，甲基红试验阴性，能使马铃薯软腐，氧化酶和过氧化氢酶阳性，硝酸还原产生H2S，V.P试验阳性，明胶液化，41℃生长等。
2.4.4病原菌碳源利用从表2可知，8个供试菌株与对照菌株测试结果大都一致，8个供试菌株可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、果糖、海藻糖、棉籽糖、甘露糖、山梨醇、甜醇、肌醇等，不能利用纤维二糖、木糖、鼠李糖、β-丙氨酸、L-亮氨酸等。
3结论与讨论
西瓜果斑病最早于1969年在美国佛罗里达州被发现[8]。我国报道西瓜果斑病在1998年[5]。Schaad等[9]在美国佐治亚州发现西瓜苗凋萎病，病原菌被首次鉴定为类产碱假单胞菌西瓜亚种（Psendomonas psendoalcaligenes subsp. citrulli）。 Willems[10]等根据西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子杂交研究结果，将其更改为Acidovorax avenae subsp. citrulli（Schaad et al.）。
我国吉林、福建[1，4]、海南、河北、山西等地都有类似病害发生，但多数研究大都引用国外的鉴定结果。本研究通过对山东省西瓜病果分离菌株的致病性测定，发现其发病病斑与自然发病症状完全一致，且从接种发病植株重新分离到完全相同的细菌。该供试菌株格兰氏染色、菌体形态、培养性状、生理生化测定等细菌学性状与张荣意[5]和赵廷昌[6]的基本相同。但个别性状如麦芽糖、棉籽糖、甘露糖、肌醇等测定结果与张荣意等的报道不同，对麦芽糖、肌醇、甜菜碱等的测定结果与赵廷昌等报道的不同。这可能由不同地区间菌系的差异或碳素化合物的纯度不同造成的。
综上所述，供试8个菌株的致病性、形态及染色反应、菌落培养性状、生理生化性状及碳源利用结果均一致，为同一种病原菌——类产碱假单胞菌西瓜亚种（Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli Schaad et al.，1978）[9，10]，即燕麦食酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992）。
我国于2006年将西瓜细菌性果斑病列入全国农业植物性有害生物。近年来，我们只对山东省个别县市西瓜细菌性果斑病进行分离鉴定。为了防止该病的危害和扩展蔓延，减少给果农造成的损失，我们正展开对全省各县市的全面调查并积极开展药剂防治试验。
参考文献：
[1]蔡学清， 黄月英， 杨建珍，等. 福建省西瓜细菌性果斑病的病原鉴定[J]. 福建农林大学学报， 2005， 34（4）： 434-437.
[2]东秀珠， 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京： 科学出版社， 2001：353-364.
[3]方中达. 植病研究方法[M].第3版.北京： 中国农业出版社， 1998：156-211.
[4]金言， 张俊杰， 吴燕华， 等. 西瓜细菌性果斑病的发生与病原菌鉴定[J]. 吉林农业大学学报， 2004， 26（3）：263-266.
[5]张荣意， 谭志琼， 文衍堂， 等.西瓜细菌果斑病症状描述和病原菌鉴定[J]. 热带作物学报， 1998， 19（1）： 70-76.
[6]赵廷昌， 孙福在， 王兵万， 等. 哈密瓜细菌性果斑病病原菌鉴定[J]. 植物病理学报， 2001， 31（4）： 357-364.
[7]中国科学院微生物研究所细菌分离组. 一般细菌常用鉴定方法[M]. 北京：中国科学院， 1978：46-49.
[8]Crall J M， Schenck N C. Bactarial fruit rat of watermelon in Florida[J]. Plant Disease Report， 1969， 53：74-75.
[9]Schaad N W， Sowell Jr. G， Goth R W， et al. Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli. subsp. nov.[J]. lnt. J. Syst. Bacteriol.， 1978， 28： 117-125.
[10]Willems A， Goor M， Thielemans S， et al. Transfer of several phyeopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax as Acidovorax avenae subsp. avenae subsp. nov.， comb. nov.， Acidovorax avenae subsp. citrulli，Acidovorax avenae subsp. cattleyae， and Acidovorax konjaci[J]. Int. J. Syst. Bacteriol，1992，42 （1）：107-119.
关键词：西瓜；细菌性果斑病；病原鉴定
中图分类号：S432.4+2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）03-0083-03
AbstractIn recent years， watermelon had been attacked by a new bacterial disease called bacterial fruit blotch （BFB） in some planting areas of Shandong Province， including Linshu， Changle and Zhangqiu. Fifteen strains were isolated from diseased fruits and leaves of watermelon. The inoculation tests were conducted with 8 strains， which produced the same symptoms as naturally infected plants. And the same strains were isolated from inoculated watermelon. Based on the mycelial morphology， staining reaction， cultural characteristics and a series of physiological and biochemical properties， the pathogens were identified as Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992.
Key wordsWatermelon； Bacterial fruit blotch； Pathogen identification
自2009年始，山东省临沭县、昌乐县、章丘市等西瓜育苗基地西瓜普遍发生一种细菌性病害，发病程度轻重不等，如临沭县西瓜育苗基地所育26万株西瓜苗全部封埋销毁，造成极大损失。2010～2013年笔者在章丘西瓜育苗基地抽检的西瓜苗上同样分离到该种细菌，根据病害症状推测是Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems， Goor ， Thieiemans， Gillis， Kersters & Ley。因此，有必要对该细菌性病害的病原菌进行系统鉴定来加以确认，为该病害的防治提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试材料2009年从山东省临沭县大棚采集的双星、京欣、极品京欣西瓜病果。对照菌株为燕麦食酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp.
citrulli Willems et al.，1992），由山东农业大学植保学院植物病理学系提供。
1.1.2培养基NA培养基为分离培养基，KB培养基用于观察荧光反应[3]。
1.2试验方法
1.2.1病原菌分离、纯化取病组织，用灭菌剖解刀切取病健交界处组织，75%酒精消毒2 s，移至0.1%升汞液消毒1～2 min，经灭菌水冲洗后置于小瓷皿中研磨，加无菌水浸20 min，然后用移菌环蘸取组织液在NA培养基划线，28℃培养48 h，长出单菌落后在NA培养基再划线，使细菌纯化。纯化后的各菌株编号保存冰箱中备用。
1.2.2马铃薯软腐将马铃薯洗净用75%酒精表面消毒，切成5 mm厚的薯片，在无菌操作下放在无菌培养皿中。将在NA培养基上培养24 h的供试菌株用移菌环接在块茎上，28℃条件下培养48 h后，观察马铃薯软腐情况。
1.2.3病原菌的致病测定8个菌株与对照菌株在28℃条件下培养24 h，配成3×108个/ml菌悬液，喷雾和刺伤接种于健康西瓜幼苗4～6叶和果实，同时以接清水为对照（CK）。在28℃下保湿48 h，之后白天光照，晚上保湿，每天注意观察发病情况。
1.2.4细菌学性状细菌的格兰氏染色、形态特征、培养性状、生理生化测定等，主要参照《植病研究方法》[3]、《一般细菌常用鉴定方法》[7]、《常见细菌系统鉴定手册》[2]等方法进行。
2结果与分析
2.1病害症状
西瓜果斑病田间可危害西瓜幼苗子叶、定植后的西瓜叶片（子叶及真叶）和果实（幼果和成熟果）。定植前幼苗发病，叶尖或叶缘出现水渍状小斑点，逐渐向子叶基部扩展为条形或不规则形暗绿色水渍状斑点，沿中脉变黑。真叶受害开始为水渍状小斑点，逐渐扩大成为多角形（因受叶脉限制）或不规则形褪绿病斑，随病情的发展，病斑逐步变为褐色，干枯下陷。西瓜果实发病后，初期在西瓜表面出现水渍状小斑点，随病情发展，病斑逐渐扩展为圆形或不规则形的大型暗绿色斑块，病斑处有大量乳白色菌液溢出，后期病斑变成褐色，并多处开裂，将西瓜剖开，西瓜果肉腐烂，出现“水瓤瓜”现象，最后引起整个果实腐烂。
2.2病原菌分离
通过分离纯化共获得8个菌株用于致病性测定和病原菌的鉴定。 2.3致病性测定
8个菌株致病性测定都表现出与田间病害症状相同的典型症状。接种发病后的病斑经再分离，其菌落性状和初分离时一致。
2.4细菌学性状鉴定
2.4.1细菌的形态及染色反应供试8个菌株格兰氏染色均呈阳性反应，菌体呈杆状，两端钝圆，大小为（2～3）mm×（0.50～0.51）mm，不产生芽孢和荚膜，单根极生鞭毛（图1）。
2.4.2病原菌培养性状供试菌株在KB培养基上28～30℃下培养48 h，菌落呈乳白色，较小、圆形、隆起、有光泽、表面光滑、不透明、无黄色、不产荧光。最适生长温度为24～30℃，41℃能生长。
2.4.3病原菌生理生化性状测定从表1可知，8个供试菌株与对照菌株测试结果一致，都不能在KB培养基产生荧光，不产生果聚糖，（氧化）精氨酸双水解酶阴性，不能产生吲哚，不能水解淀粉，甲基红试验阴性，能使马铃薯软腐，氧化酶和过氧化氢酶阳性，硝酸还原产生H2S，V.P试验阳性，明胶液化，41℃生长等。
2.4.4病原菌碳源利用从表2可知，8个供试菌株与对照菌株测试结果大都一致，8个供试菌株可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、果糖、海藻糖、棉籽糖、甘露糖、山梨醇、甜醇、肌醇等，不能利用纤维二糖、木糖、鼠李糖、β-丙氨酸、L-亮氨酸等。
3结论与讨论
西瓜果斑病最早于1969年在美国佛罗里达州被发现[8]。我国报道西瓜果斑病在1998年[5]。Schaad等[9]在美国佐治亚州发现西瓜苗凋萎病，病原菌被首次鉴定为类产碱假单胞菌西瓜亚种（Psendomonas psendoalcaligenes subsp. citrulli）。 Willems[10]等根据西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子杂交研究结果，将其更改为Acidovorax avenae subsp. citrulli（Schaad et al.）。
我国吉林、福建[1，4]、海南、河北、山西等地都有类似病害发生，但多数研究大都引用国外的鉴定结果。本研究通过对山东省西瓜病果分离菌株的致病性测定，发现其发病病斑与自然发病症状完全一致，且从接种发病植株重新分离到完全相同的细菌。该供试菌株格兰氏染色、菌体形态、培养性状、生理生化测定等细菌学性状与张荣意[5]和赵廷昌[6]的基本相同。但个别性状如麦芽糖、棉籽糖、甘露糖、肌醇等测定结果与张荣意等的报道不同，对麦芽糖、肌醇、甜菜碱等的测定结果与赵廷昌等报道的不同。这可能由不同地区间菌系的差异或碳素化合物的纯度不同造成的。
综上所述，供试8个菌株的致病性、形态及染色反应、菌落培养性状、生理生化性状及碳源利用结果均一致，为同一种病原菌——类产碱假单胞菌西瓜亚种（Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli Schaad et al.，1978）[9，10]，即燕麦食酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli Willems et al.，1992）。
我国于2006年将西瓜细菌性果斑病列入全国农业植物性有害生物。近年来，我们只对山东省个别县市西瓜细菌性果斑病进行分离鉴定。为了防止该病的危害和扩展蔓延，减少给果农造成的损失，我们正展开对全省各县市的全面调查并积极开展药剂防治试验。
参考文献：
[1]蔡学清， 黄月英， 杨建珍，等. 福建省西瓜细菌性果斑病的病原鉴定[J]. 福建农林大学学报， 2005， 34（4）： 434-437.
[2]东秀珠， 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京： 科学出版社， 2001：353-364.
[3]方中达. 植病研究方法[M].第3版.北京： 中国农业出版社， 1998：156-211.
[4]金言， 张俊杰， 吴燕华， 等. 西瓜细菌性果斑病的发生与病原菌鉴定[J]. 吉林农业大学学报， 2004， 26（3）：263-266.
[5]张荣意， 谭志琼， 文衍堂， 等.西瓜细菌果斑病症状描述和病原菌鉴定[J]. 热带作物学报， 1998， 19（1）： 70-76.
[6]赵廷昌， 孙福在， 王兵万， 等. 哈密瓜细菌性果斑病病原菌鉴定[J]. 植物病理学报， 2001， 31（4）： 357-364.
[7]中国科学院微生物研究所细菌分离组. 一般细菌常用鉴定方法[M]. 北京：中国科学院， 1978：46-49.
[8]Crall J M， Schenck N C. Bactarial fruit rat of watermelon in Florida[J]. Plant Disease Report， 1969， 53：74-75.
[9]Schaad N W， Sowell Jr. G， Goth R W， et al. Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli. subsp. nov.[J]. lnt. J. Syst. Bacteriol.， 1978， 28： 117-125.
[10]Willems A， Goor M， Thielemans S， et al. Transfer of several phyeopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax as Acidovorax avenae subsp. avenae subsp. nov.， comb. nov.， Acidovorax avenae subsp. citrulli，Acidovorax avenae subsp. cattleyae， and Acidovorax konjaci[J]. Int. J. Syst. Bacteriol，1992，42 （1）：107-119.