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摘 要 目的：了解中国女性乳腺癌TP、TS和DPD mRNA、蛋白表达水平及与临床病理之间的关系。方法：采用半定量RT-PCR的方法对经过“微选”的30例中国女性标本和17例正常乳腺标本进行mRNA相对量检测。应用免疫组化技术对微选的93例中国女性乳腺癌标本和17例正常乳腺标本进行了蛋白表达的检测。结果：正常乳腺组织和乳腺癌组织中TP、TS、DPD mRNA表达分布在一个较广的范围内。癌组织中TP mRNA明显高于正常组织（P<0．05），癌组织中TS高于正常组织，但差异无显著性意义（P>0．05）。DPDmRNA表达值在癌组织近似于正常组织。TPmRNA和蛋白的表达与肿瘤的分化呈负相关。三指标mRNA表达之间、mRNA与蛋白表达之间相关性分析表明均无相关性。结论：TP、TS、DPD在乳腺癌的表达个体差异较大，三者的联合检测将加强对患者个体肿瘤生物学特性和5-FU类疗效的评估。
关键词 胸苷磷酸化酶 胸苷酸合成酶 二氢嘧啶脱氢酶 乳腺癌
资料与方法
组织标本：乳腺癌标本共112例，17例正常乳腺组织取自良性肿瘤的周围组织。均取自河南省郑州大学第一附属医院2001～2004年手术切除标本。新鲜标本即时取材,部分置于-80℃冰箱中保存，部分以10%缓冲福尔马林液固定后常规脱水、包埋。用于RT-PCR检测的标本依照SUO[1]推荐的方法进行微选处理，首先切取4μm 厚冰冻切片HE染色，光镜下选择肿瘤区域并标记，然后修整冰冻组织块直至仅保留相应的肿瘤区域。连续20μm冰冻切片并收集到液氮冷却的Eppendolf管中备用。正常组织的选取同上。乳腺癌患者均为女性，平均年龄49．29±10．21岁，正常乳腺平均年龄51．19±11．49岁。详见表1。随机从112例标本中选取30例进行RT-PCR mRNA检测。93例（包括上述30例）进行免疫组化检测，另19例由于组织过少或临床病理资料不全而未进行免疫组化检测。常规HE切片和冰冻切片由2～3名病理医师光镜下观察，肿瘤组织学分类和分级分别依照WHO标准和Elston Ellis[2]推荐的标准，仅对浸润性导管癌进行组织学分级。见表1。
主要试剂：Unit-10柱式总RNA抽提试剂盒、逆转录酶、RNA酶抑制剂、Tag DNA合成酶等购自上海Sangon生物工程公司产品。鼠抗人TP、TS、DPD 抗体 为 Roche Germany产品。
方法：TP、TS、DPD半定量RT-PCR，引物序列（引自GENEBANK）TP Cdna；
5'-TGGCTCAGTCGGGACAGCAG-3'(上游)；
5'-TCCGCTGATCATTGGCACCT-3'(下游)；
TS cDNA: 5'-TTGCCACTGGCAAATGTAACTGTGC-3'(上游)；
5'-ACACTCTACATCATGATCGATGGTG -3'(下游)；
DPD cDNA: 5'-TAGGAAAAGCACTGCAGTACCTTGG-3'(上游)；
5'-CTGGTAGCCAGAATCATTACAGGTCATG -3'(下游)；
β-actin cDNA：5'-CAAGGCCAACCGCGAGAAGATG-3'(上游)；
5'-GTCCAGGGCGACGTAGCACAGC-3'(下游)。
TP、TS、DPD、β-actin cDNA扩增片断长度分别为152bp、290bp、134bp、330bp。由上海Sangon生物工程公司合成。RT-PCR及免疫组织化学染色过程略。
结果判定：应用电泳图像分析处理系统和GENE GENIUS凝胶图像分析仪半定量计算TP、TS、DPD的相对值。免疫组化结果参考Hiroshi依照细胞着色密度和着色强度建立以下半定量评分方法。依阳性细胞的密度：阳性细胞占0%为0分；1%～25%为1分；26%～50%为2分；﹥50%为3分。依阳性细胞的着色强度：阴性，0分；轻度着色，1分；中度着色，2分，强染色，3分。上述两分之积作为结果判定的最后得分。≥1分视为阳性，<4分视为低表达，≥4分视为高表达。
统计分析：应用SPSS 10．0统计软件包进行统计学处理。显著性标准为α=0．05。
结 果
TP、TS、DPD mRNA在正常及乳腺癌组织中的表达。TP、TS、DPD基因表达水平个体差异较大，见表2。肿瘤组织TP mRNA的表达显著高于正常组织（P<0．001）。肿瘤组织TS mRNA平均值、最高值和最低值均高于相应的正常组织，但统计学显示与正常之间的差异没有显著性的意义（P=0．302）。正常组织内DPD mRNA表达最高值和最低值均高于肿瘤组织，但平均DPD水平二者接近，无统计
学意义（P=0．644）。
癌组织中TP、TS、DPD mRNA表达的相关性。癌组织TP、TS、DPD mRNA表达水平之间无相关性。在所有观察指标中，只有组织学分级与TP表达呈负相关。
P、TS、DPD蛋白表达：TP在肿瘤细胞呈胞浆表达，强表达时可见核着色，表达具有明显的异质性，坏死的肿瘤细胞不表达。肿瘤细胞TS和DPD呈胞浆表达。TP、TS、DPD肿瘤阳性表达率分别为90．32%（84/93）、85．56%（77/90）、85．71%(78/91)，高表达率分别为36．56%，37．78%，35．16%。
TP、TS、DPD蛋白表达的相关性：癌组织中，TS、TP蛋白表达水平之间有明显相关性，pearson 相关系数为0．445 (P=0．001)。DPD与TP之间、TS与DPD之间没有相关性(P>0．05)。TP、TS、DPD蛋白表达与临床病理特征之间的关系：除TP的高表达率与组织学分级呈负相关外，其他指标均无关。
mRNA表达与蛋白表达的关系：30例肿瘤组织TP、TS、DPD 三指标的mRNA与蛋白表达之间均无相关性。
讨 论
对TP、TS、DPD 的mRNA水平和蛋白表达与乳腺癌病人年龄、肿瘤体积、淋巴结转移和组织学分级关系的研究表明，上述因素与TS、DPD的表达无关，而无论是 mRNA还是蛋白，均显示TP的表达与组织学分级呈负相关，即随着组织学分级的升高，TP表达下降，证实了Fox等的观察。这个现象也可见于其他肿瘤，间接证明肿瘤细胞是可以通过自主分泌或旁分泌细胞因子调节TP表达的。分化差的肿瘤细胞细胞因子受体减少或缺失，对表达升高调节的不敏感，造成TP表达较低。
TP、TS、DPD mRNA（半定量RT-PCR）与各自的蛋白表达（免疫组化）也不存在相关性。一般认为，TS蛋白的表达的水平主要在翻译环节受调节。TP mRNA水平与蛋白水平的关系尚未确定，Takechi等认为 DPD蛋白表达被控制在翻译后水平。由于3个基因的调节机制不清，所以，以上结果只是观察现象，确切的关系还有待于在检测方法和评价标准一致的基础上进行更深入分析。
参考文献
1 Suo H，Berner HS，Risberg B，et al.Estrogen receptor-αand C-ERBB-4 expression in breast carcinoma.VirchowsArch,2001，439:62-69.
2 Elston CW，Ellis IO.Pathological prognostic factors in breast cancer.The value of histological grade in breast cancer:experience from a large study with long-term follow-up.Histopathology，1991，19:403-10.
关键词 胸苷磷酸化酶 胸苷酸合成酶 二氢嘧啶脱氢酶 乳腺癌
资料与方法
组织标本：乳腺癌标本共112例，17例正常乳腺组织取自良性肿瘤的周围组织。均取自河南省郑州大学第一附属医院2001～2004年手术切除标本。新鲜标本即时取材,部分置于-80℃冰箱中保存，部分以10%缓冲福尔马林液固定后常规脱水、包埋。用于RT-PCR检测的标本依照SUO[1]推荐的方法进行微选处理，首先切取4μm 厚冰冻切片HE染色，光镜下选择肿瘤区域并标记，然后修整冰冻组织块直至仅保留相应的肿瘤区域。连续20μm冰冻切片并收集到液氮冷却的Eppendolf管中备用。正常组织的选取同上。乳腺癌患者均为女性，平均年龄49．29±10．21岁，正常乳腺平均年龄51．19±11．49岁。详见表1。随机从112例标本中选取30例进行RT-PCR mRNA检测。93例（包括上述30例）进行免疫组化检测，另19例由于组织过少或临床病理资料不全而未进行免疫组化检测。常规HE切片和冰冻切片由2～3名病理医师光镜下观察，肿瘤组织学分类和分级分别依照WHO标准和Elston Ellis[2]推荐的标准，仅对浸润性导管癌进行组织学分级。见表1。
主要试剂：Unit-10柱式总RNA抽提试剂盒、逆转录酶、RNA酶抑制剂、Tag DNA合成酶等购自上海Sangon生物工程公司产品。鼠抗人TP、TS、DPD 抗体 为 Roche Germany产品。
方法：TP、TS、DPD半定量RT-PCR，引物序列（引自GENEBANK）TP Cdna；
5'-TGGCTCAGTCGGGACAGCAG-3'(上游)；
5'-TCCGCTGATCATTGGCACCT-3'(下游)；
TS cDNA: 5'-TTGCCACTGGCAAATGTAACTGTGC-3'(上游)；
5'-ACACTCTACATCATGATCGATGGTG -3'(下游)；
DPD cDNA: 5'-TAGGAAAAGCACTGCAGTACCTTGG-3'(上游)；
5'-CTGGTAGCCAGAATCATTACAGGTCATG -3'(下游)；
β-actin cDNA：5'-CAAGGCCAACCGCGAGAAGATG-3'(上游)；
5'-GTCCAGGGCGACGTAGCACAGC-3'(下游)。
TP、TS、DPD、β-actin cDNA扩增片断长度分别为152bp、290bp、134bp、330bp。由上海Sangon生物工程公司合成。RT-PCR及免疫组织化学染色过程略。
结果判定：应用电泳图像分析处理系统和GENE GENIUS凝胶图像分析仪半定量计算TP、TS、DPD的相对值。免疫组化结果参考Hiroshi依照细胞着色密度和着色强度建立以下半定量评分方法。依阳性细胞的密度：阳性细胞占0%为0分；1%～25%为1分；26%～50%为2分；﹥50%为3分。依阳性细胞的着色强度：阴性，0分；轻度着色，1分；中度着色，2分，强染色，3分。上述两分之积作为结果判定的最后得分。≥1分视为阳性，<4分视为低表达，≥4分视为高表达。
统计分析：应用SPSS 10．0统计软件包进行统计学处理。显著性标准为α=0．05。
结 果
TP、TS、DPD mRNA在正常及乳腺癌组织中的表达。TP、TS、DPD基因表达水平个体差异较大，见表2。肿瘤组织TP mRNA的表达显著高于正常组织（P<0．001）。肿瘤组织TS mRNA平均值、最高值和最低值均高于相应的正常组织，但统计学显示与正常之间的差异没有显著性的意义（P=0．302）。正常组织内DPD mRNA表达最高值和最低值均高于肿瘤组织，但平均DPD水平二者接近，无统计
学意义（P=0．644）。
癌组织中TP、TS、DPD mRNA表达的相关性。癌组织TP、TS、DPD mRNA表达水平之间无相关性。在所有观察指标中，只有组织学分级与TP表达呈负相关。
P、TS、DPD蛋白表达：TP在肿瘤细胞呈胞浆表达，强表达时可见核着色，表达具有明显的异质性，坏死的肿瘤细胞不表达。肿瘤细胞TS和DPD呈胞浆表达。TP、TS、DPD肿瘤阳性表达率分别为90．32%（84/93）、85．56%（77/90）、85．71%(78/91)，高表达率分别为36．56%，37．78%，35．16%。
TP、TS、DPD蛋白表达的相关性：癌组织中，TS、TP蛋白表达水平之间有明显相关性，pearson 相关系数为0．445 (P=0．001)。DPD与TP之间、TS与DPD之间没有相关性(P>0．05)。TP、TS、DPD蛋白表达与临床病理特征之间的关系：除TP的高表达率与组织学分级呈负相关外，其他指标均无关。
mRNA表达与蛋白表达的关系：30例肿瘤组织TP、TS、DPD 三指标的mRNA与蛋白表达之间均无相关性。
讨 论
对TP、TS、DPD 的mRNA水平和蛋白表达与乳腺癌病人年龄、肿瘤体积、淋巴结转移和组织学分级关系的研究表明，上述因素与TS、DPD的表达无关，而无论是 mRNA还是蛋白，均显示TP的表达与组织学分级呈负相关，即随着组织学分级的升高，TP表达下降，证实了Fox等的观察。这个现象也可见于其他肿瘤，间接证明肿瘤细胞是可以通过自主分泌或旁分泌细胞因子调节TP表达的。分化差的肿瘤细胞细胞因子受体减少或缺失，对表达升高调节的不敏感，造成TP表达较低。
TP、TS、DPD mRNA（半定量RT-PCR）与各自的蛋白表达（免疫组化）也不存在相关性。一般认为，TS蛋白的表达的水平主要在翻译环节受调节。TP mRNA水平与蛋白水平的关系尚未确定，Takechi等认为 DPD蛋白表达被控制在翻译后水平。由于3个基因的调节机制不清，所以，以上结果只是观察现象，确切的关系还有待于在检测方法和评价标准一致的基础上进行更深入分析。
参考文献
1 Suo H，Berner HS，Risberg B，et al.Estrogen receptor-αand C-ERBB-4 expression in breast carcinoma.VirchowsArch,2001，439:62-69.
2 Elston CW，Ellis IO.Pathological prognostic factors in breast cancer.The value of histological grade in breast cancer:experience from a large study with long-term follow-up.Histopathology，1991，19:403-10.