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摘 要：研究运用SMART技术对蓝点马鲛头肾构建了cDNA文库，该文库原始文库滴度为2.26×106pfu/mL，文库容量为1.36×106pfu，符合文库构建的要求。从文库中随机挑选24个单克隆菌，以载体的通用引物进行菌落检测PCR，结果表明：重组率为95.8%，插入片段大小平均为1 000bp。该文库的构建满足了基因的分离与筛选，为进一步研究其相关基因克隆及分子生物学研究奠定基础。
关键词：蓝点马鲛；头肾；cDNA文库；构建
中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）17-36-03
Construction of cDNA Libraries and Identification of Head Kidney from Scomberomorus niphonius
Wang Danni et al.
（China filiang university，HangZhou 310018，China）
Abstract：cDNA library of Scomberomorus niphonius head kidney was constracted by SMART technology.The original library titer is 2.26×106pfu/mL，and library capacity is 1.36×106pfu，meeting the requirements of library construction. RandomLy selected 24 monoclonal bacteria from the library，subjected to colony PCR detected by using universal primers. The results showed that recombination rate was 95.8%，an average insert size was 1 000bp. Construction of the library meet the isolation and screening of gene，and lay the foundation for further study of melecμlar biology and gene cloning.
Key words：Scomberomorus niphonius；Head kidney；cDNA library；Construction
目前，分离基因最快、最有效的技术是cDNA文库的构建。cDNA文库是一种重组的克隆基因群，是以组织中的mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA，并与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接转化而形成的，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库[1]。与其他文库相比，cDNA文库中获得的基因组是已经剪切将内含子去除的cDNA，因此可以在cDNA文库中便捷地获取基因序列的信息[2]。
蓝点马鲛（Scomberomorus niphonius）属于辐鳍亚纲、鲈形目，鲭亚目、鲭科、马鲛属，普遍分布于北太平洋的西边以及中国东海、黄海、渤海及南海（以海南文昌铺前附近海域最为著名）等地。该鱼体长而扁平，纺锤形，是北方海经济鱼类。在硬骨鱼的体内存在着头肾，位置在全肾的最前端，这个部位属于淋巴组织，具有免疫的功能，可以制造白血球以及消灭陈旧的红血球的功能。由于近年来人们对蓝点马鲛的肆意捕捞以及环境的不断恶劣，导致蓝点马鲛的产量急剧减少。本研究通过构建蓝点马鲛的cDNA文库，寻找一些具有特殊功能的基因，为其深入的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 2014年5月在浙江省宁波市象山港捕捞蓝点马鲛样本12尾（平均重750±5g），取其头肾组织，并快速保存于液氮中，存于-80℃冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 提取总RNA 取蓝点马鲛的头肾组织，至于液氮中研磨，运用TRzol法提取总RNA，并取3μL进行琼脂糖凝胶电泳分析，以确定RNA的质量，并运用紫外分光光度计对RNA的纯度和浓度进行检测。
1.2.2 cDNA双链的合成 在一个200μL灭菌离心管中依次加入下列试剂，RNA（1μg），加DEPC水补足到3.25μL；5-Oligo（RT）（20μM）0.5μL；DMSO为0.5μL；然后72℃温浴3min，冰上冷却3min，短暂离心后，再依次加入下列试剂：5×First Srand Buffer 2μL，20Mm DTT（Clontech）1μL，dNTPs Mix 1μL，RNase inhibitor（40U＼μL）0.25μL；SMART Scribe RTase（Clontrch）1μL；反应条件42℃温浴1h，70℃15min，冷却到室温.然后进行第二链合成。在第二链合成离心管中依次加入First Strand cDNA 2μL，去离子水80μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 10μL，50xdNTPs Mix 2μL，5’PCR引物，3’PCR引物2μL，及50×Advantage 2 Polymerase Mix 2μL，混匀，反应条件：94℃、2min；98℃、10s，60℃、30s，68℃、3min，25个循环。反应完成后，取5μL用于琼脂糖凝胶电泳检测。其余放于-20℃保存备用。
1.2.3 cDNA与质粒载体的连接及转化 产物与pUCm-T载体用T4连接酶连接，反应体系如下：PCR产物1μL，pUCm-T载体1μL，2×快连buffer2.5μL，T4 DNA Ligase 0.5μL；反应条件：22℃、8min。将连接产物转入DH5α中，冰上放置30min，热击90s，然后再放回冰上3min，添加 600μLSOC无抗液体培养基，37℃，200振荡复苏培养1h，获得了蓝点马鲛头肾初始cDNA文库。 1.2.4 cDNA文库的容量测定 从文库中取出10μL菌液，用SOC培养基分别稀释10、100、1 000、10 000倍，然后再分别吸取100μL涂板，37℃丰培养16h。计算平板的总克隆数，公式如下：文库滴度=平板上的克隆数×稀释倍数/涂板体积）[3]，文库容量=库包装体积×滴度[4]。分别计算出cDNA文库滴度和库容量。
1.2.5 cDNA文库的质量鉴定 cDNA文库的质量鉴定主要有2种方法：一是检测文库的重组率，二是对插入片段的检测。通过应用蓝白斑筛选来鉴定文库的重组率，计算公式为：重组率（%）=白斑数/（白斑数+蓝斑数）×100[5]。对其插入片段的检测，随机挑取单克隆菌，进行菌液检测PCR，PCR反应条件为预变性94℃、5min；94℃、1min，55℃、30s，72℃、2min，35个循环；72℃延伸5min。反应结束后，进行琼脂糖电泳的检测，然后筛选阳性菌送测序。
1.2.6 序列分析 利用NCBI中的VecScreen程序识别所测序列并去除载体，利用DNAStar软件SeqMan程序比对序列，将得到在GenBank上进行BLAST比对分析后的生物EST序列。
2 结果与分析
2.1 提取总RNA和分离mRNA 总RNA的提取纯度要高，完整性较好，这是构建cDNA文库的基础。本研究选用试剂盒从蓝点马鲛头肾中获得RNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明（见图1）：18s和28s的条带都比较完整和清晰，28s条带的浓度是18s的2倍，且未发现拖尾现象，说明所提取的RNA完整性好，质量较高。经紫外分光光度计检测后，RNA浓度为均在295～325ng/μL，而且OD260/OD280均在1.8～2.0，表明RNA的纯度较高，并且达到了反转录所需的RNA浓度，可以用于cDNA文库的构建。
图1 蓝点马鲛总RNA电泳
2.2 cDNA文库滴度的测定 cDNA文库主要是通过文库滴度和文库容量来检测的。通过公式计算之后，原始文库滴度为2.26×106pfu/mL，文库容量为1.36×106pfu，而SMART文库构建要求未扩增文库的滴度大于1×106pfu/mL，所以符合建库的要求。
2.3 cDNA文库插入片段的测定 从文库中随机挑取24个单克隆菌，每个菌落加600μL含Amp抗生素的SOC液体培养基，用载体的通用引物进行菌落检测PCR。检测结果（图2）表明，挑选的这24个菌中，有23个出现了清晰条带，条带主要集中在1～2kb。根据公式可计算出该蓝点马鲛的头肾cDNA文库的重组率为95.8%，而且所构建的cDNA文库中cDNA的插入片段分布均匀，呈现出大小不一的扩增片段。可见，本实验成功的构建了蓝点马鲛头肾的cDNA文库，为后续筛选一些有功能的蛋白奠定了良好的基础。
图2 菌落检测PCR电泳
2.4 测序及EST分析 从cDNA原始文库中挑取50个单克隆菌进行测序，利用NCBI中的VecScreen程序对所测序列进行分析，并去掉载体、短序列及一些相对分子量较低的序列后，共获得了46个有效序列，将获得的EST序列利用NCBI的BlastX进行相似性比对分析，选择一些具有代表性的序列进行分析（见表1）。
表1 蓝点马鲛cDNA文库部分EST
[克隆编号＼&长度（bp）＼&相似度（%）＼&相似基因来源的物种名＼&推定蛋白种类＼&推定蛋白功能＼&S3＼&981＼&90＼&奈里朴丽鱼＼&泛素连接酶＼&是蛋白质降解的信号＼&S4＼&983＼&86＼&深裂眶锯雀鲷＼&甲基转移酶＼&能引起氨基酸转移＼&S8＼&1073＼&90＼&斑马宫丽鱼＼&真核翻译起始因子＼&参与真核生物的翻译＼&S11＼&992＼&89＼&斑马宫丽鱼＼&钙网蛋白＼&调节细胞内钙离子＼&S13＼&1028＼&86＼&大黄鱼＼&CSRP2蛋白＼&促进细胞进入有丝分裂＼&S16＼&936＼&83＼&尼罗非鱼＼&锌指蛋白＼&调控基因转录＼&S27＼&1060＼&90＼&大黄鱼＼&肽链释放因子＼&调控细胞周期，组建细胞骨架＼&S29＼&980＼&96＼&安大略鲑＼&促分裂素活化蛋白＼&促进细胞分裂＼&S36＼&1028＼&91＼&尼罗非鱼＼&SH3结构域蛋白＼&介导信号分子与富含脯氨酸的蛋白分子结合＼&S37＼&982＼&90＼&红旗东方鲀鱼＼&丝/苏氨酸蛋白激酶＼&刺激胞外基质合成＼&S39＼&1013＼&88＼&慈鲷类＼&输入蛋白＼&帮助核蛋白进入细胞核＼&S48＼&956＼&89＼&布氏新亮丽鲷＼&KLF转录因子＼&参与细胞增殖、凋亡和分化＼&S54＼&923＼&87＼&大黄鱼＼&PDZ结构域＼&调控蛋白质之间相互作用＼&S74＼&952＼&90＼&尼罗非鱼＼&BTG1蛋白＼&参与细胞代谢＼&]
3 讨论与结论
cDNA文库的构建是一种基础工具，可以研究基因的功能和发现新基因，因而被广泛运用于生物学研究领域中。目前通过cDNA文库筛选已经发现了许多基因[6]，而以蓝点马鲛为原材料构建cDNA文库尚未报道。本研究通过提取RNA，采用In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit技术，构建蓝点马鲛头肾cDNA文库，并通过对其容量、质量的检测，从而判断该文库的参考价值的。
本实验所构建的原始cDNA文库的滴度为
2.26×106pfu/mL，而构建文库一般要求其滴度≥1×106pfu/mL，与目前已经构建的cDNA文库比较，例如张少会等[7]构建的草莓果实cDNA文库原始滴度为1.13×106pfu/mL；韦春梅等[8]构建松墨天牛幼虫的cDNA文库原始滴度为5.45×106pfu/mL；陈美元[9]构建了双孢蘑菇As2796全长cDNA文库的原始滴度为3.3×106pfu/mL，经过查阅文献及比较，表明本研究所构建的文库是可以满足之后实验的需要。此外，对其插入片段进行检测，其片段长度平均为1 000bp。 高质量的RNA是活的cDNA的基础，RNA的纯度和完整性决定着cDNA文库信息的完整性[10-11]。本实验为了提高RNA的质量，不经过mRNA的纯化过程，直接用总RNA来建库，减少了mRNA的降解和丢失，可以使mRNA最大限度的转录为cDNA。此外，在LD-PCR中，设置25个循环，合成了足量的cDNA，使文库的表达序列变得富集。
参考文献
[1]萨姆布鲁克J，拉塞尔DW.分子克隆实验指南[M].第3版.北京：科学出版社，2002.
[2]CARNINCI P，SHIBATA Y，HAYATSU N，et al.Normalization and subtraction of cap-trapper-selected cDNAs to prepare full-length cDNA libraries for rapid discovery of new genes[J].Genome Res，2000，10（10）：1617-1630.
[3]王楠，周莹，姚丹，等.春大豆花芽cDNA文库的构建及质量分析[J].华南农业大学学报，2014，35（1）：73-78.
[4]蒋晶，肖熙鸥，曹必好，等.茄子青枯病诱导的cDNA文库构建与鉴定[J].江苏农业科学，2014，42（4）：22-24.
[5]张雨良，张树珍，王健华，等.感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价[J].热带作物学报，2012，33（6）：1096-1100.
[6]范睿，凌鹏，顾文亮，等.海南蒟cDNA文库的构建及评价[J].热带作物学报，2013，34（4）：36-640.
[7]张少会，沈元月.草莓果实cDNA文库的构建及鉴定[J].北京农业学院学报，2014，29（2）：12-14.
[8]韦春梅，罗淋淋，吴华俊，等.松墨天牛幼虫cDNA文库的构建及EST分析[J].基因组学与应用生物学，2014，33（1）：113-120.
[9]陈美元.双孢蘑菇As2796全长cDNA文库的构建及鉴定[J].福建农业学报，2012，27（11）：1201-1204.
[10]黄功华，梁景耀.酵母细胞中构建HL-60细胞的酵母双杂交cDNA文库[J].广东医学院学报，2004，22（1）：1-3.
[11]汤华，郑用琏.玉米耐铝毒基因的分离[J].植物生理与分子生物学学报，2005，31（5）：507-514. （责编：张宏民）
关键词：蓝点马鲛；头肾；cDNA文库；构建
中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）17-36-03
Construction of cDNA Libraries and Identification of Head Kidney from Scomberomorus niphonius
Wang Danni et al.
（China filiang university，HangZhou 310018，China）
Abstract：cDNA library of Scomberomorus niphonius head kidney was constracted by SMART technology.The original library titer is 2.26×106pfu/mL，and library capacity is 1.36×106pfu，meeting the requirements of library construction. RandomLy selected 24 monoclonal bacteria from the library，subjected to colony PCR detected by using universal primers. The results showed that recombination rate was 95.8%，an average insert size was 1 000bp. Construction of the library meet the isolation and screening of gene，and lay the foundation for further study of melecμlar biology and gene cloning.
Key words：Scomberomorus niphonius；Head kidney；cDNA library；Construction
目前，分离基因最快、最有效的技术是cDNA文库的构建。cDNA文库是一种重组的克隆基因群，是以组织中的mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA，并与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接转化而形成的，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库[1]。与其他文库相比，cDNA文库中获得的基因组是已经剪切将内含子去除的cDNA，因此可以在cDNA文库中便捷地获取基因序列的信息[2]。
蓝点马鲛（Scomberomorus niphonius）属于辐鳍亚纲、鲈形目，鲭亚目、鲭科、马鲛属，普遍分布于北太平洋的西边以及中国东海、黄海、渤海及南海（以海南文昌铺前附近海域最为著名）等地。该鱼体长而扁平，纺锤形，是北方海经济鱼类。在硬骨鱼的体内存在着头肾，位置在全肾的最前端，这个部位属于淋巴组织，具有免疫的功能，可以制造白血球以及消灭陈旧的红血球的功能。由于近年来人们对蓝点马鲛的肆意捕捞以及环境的不断恶劣，导致蓝点马鲛的产量急剧减少。本研究通过构建蓝点马鲛的cDNA文库，寻找一些具有特殊功能的基因，为其深入的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 2014年5月在浙江省宁波市象山港捕捞蓝点马鲛样本12尾（平均重750±5g），取其头肾组织，并快速保存于液氮中，存于-80℃冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 提取总RNA 取蓝点马鲛的头肾组织，至于液氮中研磨，运用TRzol法提取总RNA，并取3μL进行琼脂糖凝胶电泳分析，以确定RNA的质量，并运用紫外分光光度计对RNA的纯度和浓度进行检测。
1.2.2 cDNA双链的合成 在一个200μL灭菌离心管中依次加入下列试剂，RNA（1μg），加DEPC水补足到3.25μL；5-Oligo（RT）（20μM）0.5μL；DMSO为0.5μL；然后72℃温浴3min，冰上冷却3min，短暂离心后，再依次加入下列试剂：5×First Srand Buffer 2μL，20Mm DTT（Clontech）1μL，dNTPs Mix 1μL，RNase inhibitor（40U＼μL）0.25μL；SMART Scribe RTase（Clontrch）1μL；反应条件42℃温浴1h，70℃15min，冷却到室温.然后进行第二链合成。在第二链合成离心管中依次加入First Strand cDNA 2μL，去离子水80μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 10μL，50xdNTPs Mix 2μL，5’PCR引物，3’PCR引物2μL，及50×Advantage 2 Polymerase Mix 2μL，混匀，反应条件：94℃、2min；98℃、10s，60℃、30s，68℃、3min，25个循环。反应完成后，取5μL用于琼脂糖凝胶电泳检测。其余放于-20℃保存备用。
1.2.3 cDNA与质粒载体的连接及转化 产物与pUCm-T载体用T4连接酶连接，反应体系如下：PCR产物1μL，pUCm-T载体1μL，2×快连buffer2.5μL，T4 DNA Ligase 0.5μL；反应条件：22℃、8min。将连接产物转入DH5α中，冰上放置30min，热击90s，然后再放回冰上3min，添加 600μLSOC无抗液体培养基，37℃，200振荡复苏培养1h，获得了蓝点马鲛头肾初始cDNA文库。 1.2.4 cDNA文库的容量测定 从文库中取出10μL菌液，用SOC培养基分别稀释10、100、1 000、10 000倍，然后再分别吸取100μL涂板，37℃丰培养16h。计算平板的总克隆数，公式如下：文库滴度=平板上的克隆数×稀释倍数/涂板体积）[3]，文库容量=库包装体积×滴度[4]。分别计算出cDNA文库滴度和库容量。
1.2.5 cDNA文库的质量鉴定 cDNA文库的质量鉴定主要有2种方法：一是检测文库的重组率，二是对插入片段的检测。通过应用蓝白斑筛选来鉴定文库的重组率，计算公式为：重组率（%）=白斑数/（白斑数+蓝斑数）×100[5]。对其插入片段的检测，随机挑取单克隆菌，进行菌液检测PCR，PCR反应条件为预变性94℃、5min；94℃、1min，55℃、30s，72℃、2min，35个循环；72℃延伸5min。反应结束后，进行琼脂糖电泳的检测，然后筛选阳性菌送测序。
1.2.6 序列分析 利用NCBI中的VecScreen程序识别所测序列并去除载体，利用DNAStar软件SeqMan程序比对序列，将得到在GenBank上进行BLAST比对分析后的生物EST序列。
2 结果与分析
2.1 提取总RNA和分离mRNA 总RNA的提取纯度要高，完整性较好，这是构建cDNA文库的基础。本研究选用试剂盒从蓝点马鲛头肾中获得RNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明（见图1）：18s和28s的条带都比较完整和清晰，28s条带的浓度是18s的2倍，且未发现拖尾现象，说明所提取的RNA完整性好，质量较高。经紫外分光光度计检测后，RNA浓度为均在295～325ng/μL，而且OD260/OD280均在1.8～2.0，表明RNA的纯度较高，并且达到了反转录所需的RNA浓度，可以用于cDNA文库的构建。
图1 蓝点马鲛总RNA电泳
2.2 cDNA文库滴度的测定 cDNA文库主要是通过文库滴度和文库容量来检测的。通过公式计算之后，原始文库滴度为2.26×106pfu/mL，文库容量为1.36×106pfu，而SMART文库构建要求未扩增文库的滴度大于1×106pfu/mL，所以符合建库的要求。
2.3 cDNA文库插入片段的测定 从文库中随机挑取24个单克隆菌，每个菌落加600μL含Amp抗生素的SOC液体培养基，用载体的通用引物进行菌落检测PCR。检测结果（图2）表明，挑选的这24个菌中，有23个出现了清晰条带，条带主要集中在1～2kb。根据公式可计算出该蓝点马鲛的头肾cDNA文库的重组率为95.8%，而且所构建的cDNA文库中cDNA的插入片段分布均匀，呈现出大小不一的扩增片段。可见，本实验成功的构建了蓝点马鲛头肾的cDNA文库，为后续筛选一些有功能的蛋白奠定了良好的基础。
图2 菌落检测PCR电泳
2.4 测序及EST分析 从cDNA原始文库中挑取50个单克隆菌进行测序，利用NCBI中的VecScreen程序对所测序列进行分析，并去掉载体、短序列及一些相对分子量较低的序列后，共获得了46个有效序列，将获得的EST序列利用NCBI的BlastX进行相似性比对分析，选择一些具有代表性的序列进行分析（见表1）。
表1 蓝点马鲛cDNA文库部分EST
[克隆编号＼&长度（bp）＼&相似度（%）＼&相似基因来源的物种名＼&推定蛋白种类＼&推定蛋白功能＼&S3＼&981＼&90＼&奈里朴丽鱼＼&泛素连接酶＼&是蛋白质降解的信号＼&S4＼&983＼&86＼&深裂眶锯雀鲷＼&甲基转移酶＼&能引起氨基酸转移＼&S8＼&1073＼&90＼&斑马宫丽鱼＼&真核翻译起始因子＼&参与真核生物的翻译＼&S11＼&992＼&89＼&斑马宫丽鱼＼&钙网蛋白＼&调节细胞内钙离子＼&S13＼&1028＼&86＼&大黄鱼＼&CSRP2蛋白＼&促进细胞进入有丝分裂＼&S16＼&936＼&83＼&尼罗非鱼＼&锌指蛋白＼&调控基因转录＼&S27＼&1060＼&90＼&大黄鱼＼&肽链释放因子＼&调控细胞周期，组建细胞骨架＼&S29＼&980＼&96＼&安大略鲑＼&促分裂素活化蛋白＼&促进细胞分裂＼&S36＼&1028＼&91＼&尼罗非鱼＼&SH3结构域蛋白＼&介导信号分子与富含脯氨酸的蛋白分子结合＼&S37＼&982＼&90＼&红旗东方鲀鱼＼&丝/苏氨酸蛋白激酶＼&刺激胞外基质合成＼&S39＼&1013＼&88＼&慈鲷类＼&输入蛋白＼&帮助核蛋白进入细胞核＼&S48＼&956＼&89＼&布氏新亮丽鲷＼&KLF转录因子＼&参与细胞增殖、凋亡和分化＼&S54＼&923＼&87＼&大黄鱼＼&PDZ结构域＼&调控蛋白质之间相互作用＼&S74＼&952＼&90＼&尼罗非鱼＼&BTG1蛋白＼&参与细胞代谢＼&]
3 讨论与结论
cDNA文库的构建是一种基础工具，可以研究基因的功能和发现新基因，因而被广泛运用于生物学研究领域中。目前通过cDNA文库筛选已经发现了许多基因[6]，而以蓝点马鲛为原材料构建cDNA文库尚未报道。本研究通过提取RNA，采用In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit技术，构建蓝点马鲛头肾cDNA文库，并通过对其容量、质量的检测，从而判断该文库的参考价值的。
本实验所构建的原始cDNA文库的滴度为
2.26×106pfu/mL，而构建文库一般要求其滴度≥1×106pfu/mL，与目前已经构建的cDNA文库比较，例如张少会等[7]构建的草莓果实cDNA文库原始滴度为1.13×106pfu/mL；韦春梅等[8]构建松墨天牛幼虫的cDNA文库原始滴度为5.45×106pfu/mL；陈美元[9]构建了双孢蘑菇As2796全长cDNA文库的原始滴度为3.3×106pfu/mL，经过查阅文献及比较，表明本研究所构建的文库是可以满足之后实验的需要。此外，对其插入片段进行检测，其片段长度平均为1 000bp。 高质量的RNA是活的cDNA的基础，RNA的纯度和完整性决定着cDNA文库信息的完整性[10-11]。本实验为了提高RNA的质量，不经过mRNA的纯化过程，直接用总RNA来建库，减少了mRNA的降解和丢失，可以使mRNA最大限度的转录为cDNA。此外，在LD-PCR中，设置25个循环，合成了足量的cDNA，使文库的表达序列变得富集。
参考文献
[1]萨姆布鲁克J，拉塞尔DW.分子克隆实验指南[M].第3版.北京：科学出版社，2002.
[2]CARNINCI P，SHIBATA Y，HAYATSU N，et al.Normalization and subtraction of cap-trapper-selected cDNAs to prepare full-length cDNA libraries for rapid discovery of new genes[J].Genome Res，2000，10（10）：1617-1630.
[3]王楠，周莹，姚丹，等.春大豆花芽cDNA文库的构建及质量分析[J].华南农业大学学报，2014，35（1）：73-78.
[4]蒋晶，肖熙鸥，曹必好，等.茄子青枯病诱导的cDNA文库构建与鉴定[J].江苏农业科学，2014，42（4）：22-24.
[5]张雨良，张树珍，王健华，等.感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价[J].热带作物学报，2012，33（6）：1096-1100.
[6]范睿，凌鹏，顾文亮，等.海南蒟cDNA文库的构建及评价[J].热带作物学报，2013，34（4）：36-640.
[7]张少会，沈元月.草莓果实cDNA文库的构建及鉴定[J].北京农业学院学报，2014，29（2）：12-14.
[8]韦春梅，罗淋淋，吴华俊，等.松墨天牛幼虫cDNA文库的构建及EST分析[J].基因组学与应用生物学，2014，33（1）：113-120.
[9]陈美元.双孢蘑菇As2796全长cDNA文库的构建及鉴定[J].福建农业学报，2012，27（11）：1201-1204.
[10]黄功华，梁景耀.酵母细胞中构建HL-60细胞的酵母双杂交cDNA文库[J].广东医学院学报，2004，22（1）：1-3.
[11]汤华，郑用琏.玉米耐铝毒基因的分离[J].植物生理与分子生物学学报，2005，31（5）：507-514. （责编：张宏民）