研究艾拉莫德是否能够抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞(HLFs)活化及胶原分泌。
方法在体内,建立小鼠肺纤维化模型,分为3组:正常对照组、博莱霉素组和博莱霉素+艾拉莫德组,苏木精-伊红(HE)染色观察肺形态,马松染色观察肺内胶原积累程度,组织免疫荧光检测肺内肌成纤维细胞标志蛋白纤维连接蛋白(fibronectin)和平滑肌22蛋白(SM22),氯胺-T法检测肺组织羟脯氨酸含量。在体外,用原代人肺成纤维细胞(pHLFs)进行细胞实验评估艾拉莫德对TGF-β1刺激的影响,分为4组:正常对照组、艾拉莫德组、TGF-β1组、TGF-β1+艾拉莫德组,流式细胞术检测细胞的凋亡情况,实时荧光定量(qRT)-PCR检测细胞Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达水平,蛋白质印迹法和细胞免疫荧光检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、fibronectin、p-Smad2和p-Smad3以及转录辅助激活因子p300的蛋白水平。数据均采用单因素方差分析,两两比较用LSD-t检验或Kruskal-Wallis检验。
结果羟脯氨酸含量:正常对照组为(0.552±0.075)μg/mg,博莱霉素组为(1.293±0.081)μg/mg,博莱霉素+艾拉莫德组(0.833±0.053)μg/mg (F=169.672,P<0.01),艾拉莫德降低了小鼠肺组织羟脯氨酸含量,减少了肺内胶原积累,从而降低了博莱霉素诱导的肺纤维化程度,改善了小鼠肺部病理改变。在细胞实验中,艾拉莫德对细胞凋亡比例差异无统计学意义(F=0.83,P=0.54);Ⅰ型胶原蛋白mRNA相对表达量:正常对照组为(100.4±1.2),TGF-β1组为(299.0±13.0),TGF-β1+艾拉莫德组(202.5±7.0)(F=468.7,P<0.01);Ⅲ型胶原蛋白mRNA相对表达量:正常对照组为(99.8±1.9),TGF-β1组为(350.6±8.0),TGF-β1+艾拉莫德组(220.3±9.9)(F=468.7,P<0.01);α-SMA蛋白相对表达量:正常对照组为(0.193±0.038),TGF-β1组为(0.530±0.061),TGF-β1+艾拉莫德组为(0.410±0.065)(F=35.620,P<0.01);Fibronectin蛋白相对表达量:正常对照组为(0.200±0.020),TGF-β1组为(0.700±0.020),TGF-β1+艾拉莫德组为(0.410±0.066)(F=123.326,P<0.01);p-Smad3蛋白相对表达量:正常对照组为(0.120±0.020),TGF-β1组为(0.573±0.586),TGF-β1+艾拉莫德组为(0.327±0.252)(F=92.987,P<0.01);p300蛋白相对表达量:正常对照组为(0.180±0.055),TGF-β1组为(0.923±0.025),TGF-β1+艾拉莫德组(0.650±0.050)(F=207.676,P<0.01)。艾拉莫德显著降低TGF-β1诱导的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达水平,抑制α-SMA、Fibronectin、p300蛋白表达,以及Smad2、Smad3蛋白的磷酸化。
结论艾拉莫德能够经Smad3/p300通路抑制TGF-β1介导的人肺成纤维细胞活化及胶原分泌,它可能作为一种有效的抗纤维化药物用于延缓PF的进展。