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【摘 要】 目的：利用酵母膏（YEP）及氧嗪酸（OA）作为诱导剂，血浆尿酸水平为检测指标，建立高尿酸血症动物模型；并通过动物模型的瑞舒伐他汀钙药物干预，监测血清尿酸（UA）及C-反应蛋白（CPR）指标及CPR蛋白表达水平，综合分析，评价瑞舒伐他汀钙对高尿酸血症大鼠炎性因子的疗效。方法：1）将36之SD大鼠随机分为空白对照组，高尿酸血症模型组，高尿酸血症+瑞舒伐他汀钙10.0m g·kg-1·d-1组。以YEP 21g·kg-1·d-1给予喂养，OA以200mg-1·kg-1·d-1腹腔注射，瑞舒伐他汀钙以10.0m g·kg-1·d-1剂量灌胃，于建立模型同时进行药物干预，持续给药6周后鉴定该药对血清UA及CPR水平并取出胸主动脉监测血管内皮组织CRP表达水平的影响。结果：1）模型组血UA及CRP水平显著升高，主动脉内皮组织CRP表达水平增强，与空白对照组呈明显对比；2）瑞舒伐他汀钙干预高尿酸血症动物模型后瑞舒伐他汀钙降低血清UA及CRP水平，以及CRP蛋白表达水平的效应显著。结论：本研究结果表明瑞舒伐他汀钙对高尿酸血症所致大鼠炎症反应具有明显疗效，炎症反应的改善可能是瑞舒伐他汀钙能降低尿酸的作用机制之一。
【关键词】 高尿酸血症 氧嗪酸钾盐 炎性因子 瑞舒伐他汀钙
高尿酸血症（hyperuricemia）在临床较为常见，是指细胞外液的尿酸盐呈超饱和状态[1]，属于代谢性疾病。根据国内外临床研究报道，血清hs-CRP水平与血尿酸，24 h尿尿酸有显著正相关关系，提示尿酸代谢紊乱是高尿酸血症患者血清hs-CRP水平升高的重要相关因素[2]。本研究采用YEP及OA诱导建立大鼠高尿酸血症模型，在整体水平观察高尿酸血症对血管炎性反应以及瑞舒伐他汀钙对其的影响，并进一步观察瑞舒伐他汀钙血管炎性反应作用的可能机制。
1 研究方法
1.1 实验动物药物干预
将36只雄性SD大鼠（由新疆医科大学第一附属医院动物实验室提供）随机分为3组（12只/组），模型制作和药物干预同步进行，持续6周。动物以YEP21g·kg-1·d-1给予喂养，其方法参照文献[3，4]0A用灭菌热蒸馏水配成20g/L母液，以200mg-1·kg-1·d-1腹腔注射，其空白对照组动物以普通饲料喂养，自由饮水。参照瑞舒伐他汀钙的临床用药剂量和实验动物研究报道[4，5]热蒸馏水配成5mg/1ml母液，按10.0m g·kg-1·d-1剂量灌胃。
1.2 标本收集
药物干预开始后，分周（0、2、4和6周）和分批采集大鼠摘眼球取抗凝血2ml，离心分离血清、分装并保存于-80℃冰箱。6周后，利用1%戊巴比妥钠40mg·kg-1腹腔注射麻醉，开腹取出大鼠胸主动脉，用15%中性福尔马林固定后，石蜡包埋并切成 4μm厚的组织切片，保存于-80℃，用于免疫组化学鉴定。
1.3 指标检测
利用UA及CRP试剂盒和DXC800 SYNCHRON生化分析系统测定以上代谢产物的血清含量，具体遵照厂家提供的说明书和仪器操作常规方法。
1.4 免疫组织化学方法
固定和石蜡包埋胸主动脉福尔马林（4?m）进行脱蜡和水化。抗原在缓冲区（1mmol/L EDTA /磷酸盐缓冲盐水，pH 9）在98°C在水中30分钟浴。内源性过氧化氢阻断进行3%过氧化氢10分钟。接下来入兔抗鼠CRP抗体（一抗，Santa Cruz）在4°C染色切片。次日每张切片加入山羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体（二抗，Goat-anti-rabbit-HRPO）并显棕黄色。在光学显微镜下五个随机视野观察CRP阳性细胞染色强度。NSCLC PBAD表达阳性程度得分为：0，0%；1，1%–25%；2，26%–50%；3，51%–75%或4，76%-100%。得分为：0，无污点；1，稻草黄；2，棕色；和3，暗褐色的。根据阳性细胞着色强的百分比。取1cm个胸主动脉平滑肌平均得分为n。0分为阴性（-），04分为强阳性（+++）。
1.5 统计学分析
应用SPSS17.0统计软件包进行统计学处理。所有实验数据以x±SD表示，用One-Way ANOVA作统计推断，多组间两两比较采用单因素方差分析（LSD法），方差不齐者采用Tamhane法，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 高尿酸血症模型大鼠血UA水平的变化
表1可见，用药2周后模型组血UA较其他组显著升高（P<0.01），6周后模型组仍高于其他组（P<0.01）。实验 2周时瑞舒伐他汀钙UA水平低于模型组（P<0.01），但较空白对照组高（P<0.05）； 6周时趋向于正常，与对照组比较无统计学差异（P>0.05）。
2.2 各组大鼠血清CRP水平的变化
表2可见，实验2周后模型组和药物干预组血清CRP水平均开始升高，与空白对照组比较有统计学差异（P<0.01）；4周至6周，模型组CRP水平继续升高，与空白对照组及药物干预组比较有统计学差异（P<0.01）。实验4周起，药物干预组CRP水平开始下降，到了6周，CRP水平下降显著，与模型组有显著统计学差异（P<0.01）。
2.3 各组大鼠动脉组织CRP表达的判定
模型组CRP表达为强阳性，空白对照组CRP的表达为阴性（P<0.05）。瑞舒伐他汀钙10mg/kg干预组CRP表达强度较模型组显著减弱，有统计学差异（P<0.05）。
3 讨论
近些年来，众多研究发现[6，7，8]高尿酸血症与CRP、TNF-α、IL-6等炎性因子有密切关系，Kanellis等[9]学者发现，在培养的人内皮细胞和血管平滑肌细胞均有C-反应蛋白mRNA和蛋白表达，提示血管细胞是产生C-反应蛋白的另一来源，尿酸能上调C-反应蛋白的表达，这进一步提供了尿酸的前炎症因子和致动脉粥样硬化作用的直接证据。本研究通过检测炎症反应相关性血清指标后发现，高尿酸血症大鼠血清UA升高的同时，血清CRP水平也显著升高。CRP染色后出现主动脉内皮细胞胞浆呈阳性反应，表现为内皮细胞胞浆有较多棕黄色颗粒，CRP的蛋白表达显示强阳性，炎性因子升高程度蛋白表达强度与尿酸水平呈正相关性。与文献报道一致。有学者认为[10]，尿酸盐本身作为启动白细胞释放炎症因子的始动因素[11]，可能不仅引起炎性损伤，还参与炎性损伤的发生、发展。 本研究结果提示，瑞舒伐他汀钙显著降低血清CRP同时减弱主动脉内皮细胞CRP的表达。他汀类药物的抗炎的可能机制包括[12]：1）抑制巨噬细胞生成细胞因子，并通过降低巨噬细胞的活性稳定斑块；2）抑制黏附分子表达。他汀类药物通过减少血管内皮细胞表达的P选择素、细胞间黏附分子1（ICAM-1）、巨噬细胞黏附分子1（Mac-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）及单核细胞表达的CD11b/CD18和CD40增加，抑制单核细胞与内皮细胞的黏附，从而减少血管实质的损伤[13]；3）降低C-反应蛋白，C-反应蛋白是炎症急性期的反应产物，在早期动脉粥样硬化斑块中就有沉积，其水平可反映与缺血性病理相关的炎症程度。
参考文献
[1] Johnson， Richard J， Kang， et al. Is There a Pathogenetic Role for Uric Acid in Hypertension and Cardiovascular and Renal Disease？[J]. 2003 American Heart Association. 2003， 41（6）：1183-90.
[2] 李佳， 李晨钟， 薛耀明等. 高尿酸血症患者血清炎症介质水平与胰岛素抵抗. 华中科技大学学报（医学版）[J]. 2006， 35（6）：804-06
[3] 陈光亮， 张清林， 马晓芹等. 酵母致小鼠高尿酸血症模型[J]. 中国药理学通报， 2003， 19（4）：467-9.
[4] 陈 奇. 中药药理研究方法学[M]. 人民卫生出版社. 2000：1103-05.
[5] 马培奇. 美FDA批准瑞舒伐他汀钙治疗无心血管疾病临床证据成人以降低他们的心血管疾病风险[J]. 上海医药， 2010， 31（4）：192.
[6]Singh U， Dasu M， Yancey PG， et al. Human C-reactive protein promotes oxidized low density lipoprotein uptake and matrix metalloproteinase-9 release in Wistar rats[J]. J Lipid Res， 2008， 49（5）：1015-23.
[7]Siqueira DA， Sousa AG， et al. Correlation between plaque composition as assessed by virtual histology and C-reactive protei[J]n. Arq Bras Cardiol 2013 Jun Epub ahead of print]
[8]宓宇仙， 景影， 甄锡云等. 超敏C反应蛋白、血尿酸与无症状腔隙性脑梗死的关系[J]. 中国实验诊断学， 2009， 13（7）：943-4.
[9]左 勇. 冠心病患者血清尿酸和超敏C反应蛋白的测定及分析[J]. 中国误诊学杂志， 2010， 10（13）：3087-8.
[10]Tsunoda S， Kamide K， Minazni J， et al. Decreases in serum uric acid by amelioration of insulin resistence in overweight hypertensive patients：Effect of a low-energy diet and an insulin-sensitising agent[J]. AmJ Hypertens， 2002， 15：697-01.
[11]aranlilloM， GodboutM， NaeeaehePH， et al. Signaling events involved in macrophage chemokin exression in response to monosodium urate crystals[J]. J Biol Chem， 2004， 279：52797-805.
[12]金鑫， 李拥军. 他汀类药物在心血管疾病中应用的研究进展[J]. 临床荟萃， 2010， 25（1）：86-9.
[13]Tsiara S， Elisaf M， Mikhailidis DP. Early vascular benefits ofstatin therapy[J]. Curr Med Res Opin， 2003， 19（6）：540-556.
【关键词】 高尿酸血症 氧嗪酸钾盐 炎性因子 瑞舒伐他汀钙
高尿酸血症（hyperuricemia）在临床较为常见，是指细胞外液的尿酸盐呈超饱和状态[1]，属于代谢性疾病。根据国内外临床研究报道，血清hs-CRP水平与血尿酸，24 h尿尿酸有显著正相关关系，提示尿酸代谢紊乱是高尿酸血症患者血清hs-CRP水平升高的重要相关因素[2]。本研究采用YEP及OA诱导建立大鼠高尿酸血症模型，在整体水平观察高尿酸血症对血管炎性反应以及瑞舒伐他汀钙对其的影响，并进一步观察瑞舒伐他汀钙血管炎性反应作用的可能机制。
1 研究方法
1.1 实验动物药物干预
将36只雄性SD大鼠（由新疆医科大学第一附属医院动物实验室提供）随机分为3组（12只/组），模型制作和药物干预同步进行，持续6周。动物以YEP21g·kg-1·d-1给予喂养，其方法参照文献[3，4]0A用灭菌热蒸馏水配成20g/L母液，以200mg-1·kg-1·d-1腹腔注射，其空白对照组动物以普通饲料喂养，自由饮水。参照瑞舒伐他汀钙的临床用药剂量和实验动物研究报道[4，5]热蒸馏水配成5mg/1ml母液，按10.0m g·kg-1·d-1剂量灌胃。
1.2 标本收集
药物干预开始后，分周（0、2、4和6周）和分批采集大鼠摘眼球取抗凝血2ml，离心分离血清、分装并保存于-80℃冰箱。6周后，利用1%戊巴比妥钠40mg·kg-1腹腔注射麻醉，开腹取出大鼠胸主动脉，用15%中性福尔马林固定后，石蜡包埋并切成 4μm厚的组织切片，保存于-80℃，用于免疫组化学鉴定。
1.3 指标检测
利用UA及CRP试剂盒和DXC800 SYNCHRON生化分析系统测定以上代谢产物的血清含量，具体遵照厂家提供的说明书和仪器操作常规方法。
1.4 免疫组织化学方法
固定和石蜡包埋胸主动脉福尔马林（4?m）进行脱蜡和水化。抗原在缓冲区（1mmol/L EDTA /磷酸盐缓冲盐水，pH 9）在98°C在水中30分钟浴。内源性过氧化氢阻断进行3%过氧化氢10分钟。接下来入兔抗鼠CRP抗体（一抗，Santa Cruz）在4°C染色切片。次日每张切片加入山羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体（二抗，Goat-anti-rabbit-HRPO）并显棕黄色。在光学显微镜下五个随机视野观察CRP阳性细胞染色强度。NSCLC PBAD表达阳性程度得分为：0，0%；1，1%–25%；2，26%–50%；3，51%–75%或4，76%-100%。得分为：0，无污点；1，稻草黄；2，棕色；和3，暗褐色的。根据阳性细胞着色强的百分比。取1cm个胸主动脉平滑肌平均得分为n。0分为阴性（-），0
1.5 统计学分析
应用SPSS17.0统计软件包进行统计学处理。所有实验数据以x±SD表示，用One-Way ANOVA作统计推断，多组间两两比较采用单因素方差分析（LSD法），方差不齐者采用Tamhane法，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 高尿酸血症模型大鼠血UA水平的变化
表1可见，用药2周后模型组血UA较其他组显著升高（P<0.01），6周后模型组仍高于其他组（P<0.01）。实验 2周时瑞舒伐他汀钙UA水平低于模型组（P<0.01），但较空白对照组高（P<0.05）； 6周时趋向于正常，与对照组比较无统计学差异（P>0.05）。
2.2 各组大鼠血清CRP水平的变化
表2可见，实验2周后模型组和药物干预组血清CRP水平均开始升高，与空白对照组比较有统计学差异（P<0.01）；4周至6周，模型组CRP水平继续升高，与空白对照组及药物干预组比较有统计学差异（P<0.01）。实验4周起，药物干预组CRP水平开始下降，到了6周，CRP水平下降显著，与模型组有显著统计学差异（P<0.01）。
2.3 各组大鼠动脉组织CRP表达的判定
模型组CRP表达为强阳性，空白对照组CRP的表达为阴性（P<0.05）。瑞舒伐他汀钙10mg/kg干预组CRP表达强度较模型组显著减弱，有统计学差异（P<0.05）。
3 讨论
近些年来，众多研究发现[6，7，8]高尿酸血症与CRP、TNF-α、IL-6等炎性因子有密切关系，Kanellis等[9]学者发现，在培养的人内皮细胞和血管平滑肌细胞均有C-反应蛋白mRNA和蛋白表达，提示血管细胞是产生C-反应蛋白的另一来源，尿酸能上调C-反应蛋白的表达，这进一步提供了尿酸的前炎症因子和致动脉粥样硬化作用的直接证据。本研究通过检测炎症反应相关性血清指标后发现，高尿酸血症大鼠血清UA升高的同时，血清CRP水平也显著升高。CRP染色后出现主动脉内皮细胞胞浆呈阳性反应，表现为内皮细胞胞浆有较多棕黄色颗粒，CRP的蛋白表达显示强阳性，炎性因子升高程度蛋白表达强度与尿酸水平呈正相关性。与文献报道一致。有学者认为[10]，尿酸盐本身作为启动白细胞释放炎症因子的始动因素[11]，可能不仅引起炎性损伤，还参与炎性损伤的发生、发展。 本研究结果提示，瑞舒伐他汀钙显著降低血清CRP同时减弱主动脉内皮细胞CRP的表达。他汀类药物的抗炎的可能机制包括[12]：1）抑制巨噬细胞生成细胞因子，并通过降低巨噬细胞的活性稳定斑块；2）抑制黏附分子表达。他汀类药物通过减少血管内皮细胞表达的P选择素、细胞间黏附分子1（ICAM-1）、巨噬细胞黏附分子1（Mac-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）及单核细胞表达的CD11b/CD18和CD40增加，抑制单核细胞与内皮细胞的黏附，从而减少血管实质的损伤[13]；3）降低C-反应蛋白，C-反应蛋白是炎症急性期的反应产物，在早期动脉粥样硬化斑块中就有沉积，其水平可反映与缺血性病理相关的炎症程度。
参考文献
[1] Johnson， Richard J， Kang， et al. Is There a Pathogenetic Role for Uric Acid in Hypertension and Cardiovascular and Renal Disease？[J]. 2003 American Heart Association. 2003， 41（6）：1183-90.
[2] 李佳， 李晨钟， 薛耀明等. 高尿酸血症患者血清炎症介质水平与胰岛素抵抗. 华中科技大学学报（医学版）[J]. 2006， 35（6）：804-06
[3] 陈光亮， 张清林， 马晓芹等. 酵母致小鼠高尿酸血症模型[J]. 中国药理学通报， 2003， 19（4）：467-9.
[4] 陈 奇. 中药药理研究方法学[M]. 人民卫生出版社. 2000：1103-05.
[5] 马培奇. 美FDA批准瑞舒伐他汀钙治疗无心血管疾病临床证据成人以降低他们的心血管疾病风险[J]. 上海医药， 2010， 31（4）：192.
[6]Singh U， Dasu M， Yancey PG， et al. Human C-reactive protein promotes oxidized low density lipoprotein uptake and matrix metalloproteinase-9 release in Wistar rats[J]. J Lipid Res， 2008， 49（5）：1015-23.
[7]Siqueira DA， Sousa AG， et al. Correlation between plaque composition as assessed by virtual histology and C-reactive protei[J]n. Arq Bras Cardiol 2013 Jun Epub ahead of print]
[8]宓宇仙， 景影， 甄锡云等. 超敏C反应蛋白、血尿酸与无症状腔隙性脑梗死的关系[J]. 中国实验诊断学， 2009， 13（7）：943-4.
[9]左 勇. 冠心病患者血清尿酸和超敏C反应蛋白的测定及分析[J]. 中国误诊学杂志， 2010， 10（13）：3087-8.
[10]Tsunoda S， Kamide K， Minazni J， et al. Decreases in serum uric acid by amelioration of insulin resistence in overweight hypertensive patients：Effect of a low-energy diet and an insulin-sensitising agent[J]. AmJ Hypertens， 2002， 15：697-01.
[11]aranlilloM， GodboutM， NaeeaehePH， et al. Signaling events involved in macrophage chemokin exression in response to monosodium urate crystals[J]. J Biol Chem， 2004， 279：52797-805.
[12]金鑫， 李拥军. 他汀类药物在心血管疾病中应用的研究进展[J]. 临床荟萃， 2010， 25（1）：86-9.
[13]Tsiara S， Elisaf M， Mikhailidis DP. Early vascular benefits ofstatin therapy[J]. Curr Med Res Opin， 2003， 19（6）：540-556.