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摘要 [目的]比较3个典型湿地的脱氮潜能，探讨微生物学机制。[方法]在湿地中实地采样，测定基质脱氮能力，通过高通量及实时定量PCR分析微生物学机制。[结果]黄河三角洲自然湿地（YRD）更有利于NO.-3的去除，东汶河人工湿地（DWR）与小湄河河流湿地（XMR）更有利于NH.+4的去除。DWR中nobL的拷贝数最高，而在YRD与XMR中差异不大；YRD基质中amoA的拷贝数低于DWR和XMR中。β-变形菌（β-Proteobacteria）在DWR和XMR中的相对丰度最高，而YRD中γ-变形菌（γ-Proteobacteria）最高。蓝藻细菌（Cyanobateria）在DWR和XMR群落中占据比较重要的地位。[结论]虽然YRD中反硝化菌的数量最少，但是γ-Proteobacteria较高的丰度导致反硝化能力较高；而DWR与XMR具有较多的硝化和反硝化细菌，但是基质类型更有利于发生硝化反应。
关键词 湿地；微生物群落；功能基因；脱氮；环境因素
中图分类号 S181 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0035-04
Abstract [Objective] To compare the potential capacity of denitrification in three typical wetlands and study the microbiology mechanism. [Method] Collecting samples in situ， to determine nitrogen removal capacity of substrate and study microbiological mechanism by means of qPCR and highthroughput sequencing analysis. [Result] YRD was more conducive to removing NO.-3， while DWR and XMR were more conducive to removing NH.+4. DWR had the highest copy of nobL， while there was no significant difference between YRD and XMR. YRD had the lowest copy of amoA. The relative abundance of βProteobacteria in DWR and XMR was the highest， while in YRD was γProteobacteria. Cyanobateria played an important role in DWR and XMR. [Conclusion] Although YRD has the lowest copy of denitrifying bacteria， the high abundance of γ Proteobacteria leads to strong denitrifying ability. DWR and XMR have more nitrifying and denitrifying bacteria， but the type of substrate is more conducive to nitrifying reaction.
Key words Wetland；Microflora；Function gene；Denitrification；Environmental factor
湿地是陆地生态系统和水生生态系统相互作用形成的独特的生态系统。湿地在种群、生态系统和全球生态3个不同等级尺度上都有重要的生态功能，被称为“生物超市”“文明的发源地”和“地球之肾”[1]。湿地有2种基本类型：天然湿地和人工湿地[2]。根据系统内的水力水流特性，人工湿地分为表流人工湿地和潜流人工湿地两大类[3]。表流湿地与自然湿地相似，在饱和土壤基质上有浅层水面覆盖流动（通常小于60 cm深）[4]，也是工程应用较多的一种湿地类型。
长久以来水体中氮素累积一直是一个令人担忧的问题。湿地中的无机氮主要有氨氮（NH.+4）、亚硝酸盐（NO.-2）和硝酸盐（NO.-3）[5]。湿地脱氮主要包括微生物氨化、硝化-反硝化以及植物吸收和物理化学转化，如沉淀和离子交换等[6]。其中微生物转化是最重要的去除过程，占60%以上[7]。氮转化的相关微生物功能基因主要有氨单氧酶（amoA）、膜结合硝酸还原酶（narG）、含铜亚硝酸还原酶（nirK）、含cd1的亚硝酸还原酶（nirS）和一氧化氮还原酶（nosZ）。研究表明，氨氮去除率受amoA控制，硝态氮去除率受narG基因影响[8]。
不同湿地类型对氮去除效果差异较大。据报道，湿地通过氨化作用去除氮的量为0.004～0.530 g/（m.2·d），通过硝化作用去除氮的量為0.010～2.150 g/（m.2·d），通过反硝化作用去除氮的量为0.003～1.020 g/（m.2·d）[9]。按照湿地形态学分类，我国的湿地类型主要为自然湿地、人工湿地和河流湿地。笔者研究了3种湿地类型基质的潜在脱氮能力，利用荧光定量PCR和高通量测序技术解析了其微生物学机制，以期为工程中湿地类型的选择提供理论依据和科学支撑。
1 材料与方法
1.1 选址与采样
试验选取山东省内3处典型的湿地类型：①东营的黄河三角洲湿地（YRD，山东省最大的自然湿地），②蒙阴的东汶河湿地（DWR，人工湿地），③聊城的小湄河湿地（XMR，河流湿地）（图1）。采用梅花取样方法，每个湿地取3个土样（0～20 cm深），将收集的每个土样在除去根系和有机物后混合均匀，然后立即放入密闭的塑料袋中保鲜并转移到实验室，4 h内进行进一步的样品处理。 1.2 理化性质分析
取样时，分别使用温度计、pH计（PHS-3C）和溶解氧仪（HQ30d 53LEDTM，HACH，USA）测定温度、pH和溶解氧（DO）。使用1 mol/L的氯化钾溶液提取基质中NH.+4、NO.-3和NO2.-，测定其含量。另外，使用重铬酸钾氧化法确定土壤中的有机碳含量（TOC）。
1.3 潜在氮去除试验
转移5 g基质样品到100 mL经氩气冲洗过的玻璃瓶中，并加入50 mL氩气清洗过的去离子水。随后，将样品分成3组并进行不同的处理，分别是：①对照组，②添加NO.-3 组，③添加NH.+4组。将上述装有样品液的烧瓶放置于暗处，室温下培养24 h。在试验开始（加入氮源后0 h）和末尾（加入氮源后24 h）取水样分析系统中氮和有机物的转化。其中，水样经离心分离并过0.45 μm滤膜后测定样品中的NH.+4、NO.-3和NO.-2含量。
1.4 样品DNA分析
使用土壤DNA提取试剂盒（MoBio，USA）提取总群落DNA。DNA浓度和纯度用超微量分光光度计（Nano-Drop Technologies，USA）进行分析。选取amoA、AOA、amx、nobL、narG、nirK、nirS和nosZ进行qPCR，具体方法见参考文献[10]，所有的样品测量都设3个平行。每次qPCR试验都包含1个阴性对照。在上海源序生物科技有限公司（Shanghai，China）進行高通量测序。
2 结果与分析
2.1 湿地水质和基质的理化性质
3个湿地的温度相似。从表1可以看出，3个湿地上覆水pH为8～9，说明3个湿地都偏碱性。其中YRD的pH最大，碱性最强，其次是DWR。而3个湿地上覆水DO差异较大，DWR的DO最高（3.63 mg/L），而XMR的DO只有1.68 mg/L，可能是因为XMR和YRD的土壤为致密黏壤土，DWR为沙子，空隙比较大，利于基质中DO的传输[10]。3个湿地上覆水中，YRD的NH.+4、NO.-2、NO.-3和TOC浓度都是最低的，这与YRD是天然湿地，几乎没有污水排入有关。城市污水导致人工湿地中氮和TOC的浓度变高[11]。DWR中NH.+4、NO.-2、NO.-3浓度高于XMR，这是由于DWR用于净化污水处理厂出水，而XMR是河道湿地，植物种类繁多，能够摄取水中NH.+4、NO.-2和NO.-3等污染物[12]。DWR中TOC浓度略低于XMR，这可能是因为DO在DWR中的浓度比XMR高1.95 mg/L。与此同时，XMR湿地中植物较多，在秋末冬初会腐烂，进而导致XMR内的TOC浓度升高。水中较高的氮含量导致在基质中相应含量较高，比如DWR基质的NO.-3浓度最高，达1.59 mg/kg，然而在YRD和XMR中并未检测到NO.-3（表2）。这是由于DWR地表水中DO较高，抑制了反硝化细菌的作用，造成NO.-3浓度升高。在3个湿地基质中，NH.+4浓度与DO呈负相关，而NO.-2几乎无法检测到。这可能是因为湿地基质DO较低，从而抑制了硝化细菌的活性。
2.2 潜在氮去除试验结果
通过研究试验前后水样中氮浓度变化，可以确定不同类型湿地基质对氮的转化能力。从图2a可以看出，YRD和XMR对照组中氮的浓度几乎不变。而DWR中NO.-3的浓度从0.15 mg/L增加到0.86 mg/L，这可能是由于DWR基质中含有NO.-3释放的结果。从图2b可以看出，添加NO.-3后，YRD中NO.-3的浓度从5.86 mg/L降低到355 mg/L，而NO.-2的浓度从0.02 mg/L增加到0.85 mg/L，说明YRD中硝酸盐变为亚硝酸盐，这是反硝化的第一步[13]。而DWR和XMR中，添加NO.-3反应前后，NO.-3几乎没有变化，可能跟其本身NO.-3累积，而DO相对较高比例与反硝化反应的发生有关。从图2c可以看出，在添加NH.+4后，XMR的NH.+4浓度降低最多，达3.50 mg/L，硝酸盐和亚硝酸盐浓度分别增加了2.30 mg/L和0.70 mg/L。这可能是由于XMR发生了部分硝化反应。DWR的NH.+4浓度从4.80 mg/L下降到3.00 mg/L，而NO.-3浓度从0.41 mg/L提高到1.60 mg/L，表明发生了硝化过程[14]。虽然XMR中消耗的NH.+4量最多，但是在XMR中发现了NO.-2的积累，说明在XMR中硝化反应进行不彻底，这可能是由于XMR中DO浓度不足以进行完全硝化反应。而在YRD中，基本未检测到NH.+4浓度变化。
2.3 实时荧光定量PCR结果
图3a代表了反硝化过程相关基因，在3个湿地中narG和nosZ的拷贝数没有显著差异，而DWR与XMR中narG的拷贝数高于YRD。虽然YRD中反硝化细菌的数量比DWR中少，但在添加硝酸盐的试验中表明，YRD更容易进行反硝化。结果表明，与反硝化有关的功能基因的数量与湿地基质的反硝化有一定的关系，但并不绝对。反硝化受多种因素的影响，包括硝酸盐浓度、不同植物种类的残留、O2的缺失、反硝化剂的存在、覆水的存在等[15]。图3b显示DWR中的nobL拷贝数为1.2×10.11 copies/g，而在YRD与XMR中nobL拷贝数约为3.0×10.9 copies/g。这可能是因为DWR的DO浓度高于另外2个湿地，相对有利于硝化细菌的生长。通过比较3个不同的湿地厌氧氨氧化基因的拷贝数，发现YRD的AOA拷贝数（3.0×10.8 copies/g）低于DWR（4.0×10.9 copies/g）和XMR（3.5×10.9 copies/g）。
2.4 高通量测序结果
高通量测序结果表明，DWR、XMR和YRD底泥样品中的微生物群落结构存在明显差异。图4显示在门水平上，3个样品中相对丰度最高的2个菌种为变形菌门（Proteobacteria），分别为60.0%（DWR）、56.0%（XMR）和61.0%（YRD）；其次是拟杆菌门（Bacteroidetes），分别为12.0%（DWR）、21.0%（XMR）和20.0%（YRD）。此外，具有光合作用的蓝藻细菌（Cyanobateria）在DWR和XMR群落中也占据比较重要的地位，相对丰度分别为8.5%和67%，而该类光合细菌在YRD中的相对丰度仅有0.2%。图5a是样品群落中变形菌门的进一步分析结果，DWR和XMR中的主导变形菌为β-变形菌（β-Proteobacteria），而YRD中的主导变形菌为γ-Proteobacteria。图5b对拟杆菌门进行了进一步划分，从图中可以看出，3个样品群落中的主导菌种均为拟杆菌（Bacteroidia）和未定地位的拟杆菌（Bacteroidetes incertae sedis），但XMR样品中这2类菌种的相对丰度之和明显大于另外2个样品。结合图4与图5的分析可以得出结论：γ-变形菌（γ-Proteobacteria）导致了YRD中较好的反硝化能力[16]，而β-Proteobacteria和Cyanobateria造成了DWR和XMR较好的硝化能力[17-18]。 3 结论
虽然YRD中反硝化菌的数量最少，但是较低的DO和γ-Proteobacteria较高的丰度导致了反硝化能力较高；而DWR与XMR具有较多的硝化和反硝化细菌，但是较高的DO和β-Proteobacteria和Cyanobateria更有利于发生硝化反应。
参考文献
[1] WOOD A.Constructed wetlands in water pollution control：Fundamentals to their understanding[J].Water science and technology，1995，32（3）：21-29.
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[8] ZHI W，YUAN L，JI G D，et al.Enhanced longterm nitrogen removal and its quantitative molecular mechanism in tidal flow constructed wetlands[J].Environmental science & technology，2015，49（7）：4575-4583.
[9] REDDY K R，D’ANGELO E M.Biogeochemical indicators to evaluate pollutant removal efficiency in constructed wetlands[J].Water science and technology，1997，35（5）：1-10.
[10] LIU J N，YANG Z C，YU W J，et al.Relationship between nitrogen transformation and its related genes：Comparison among riparian，marsh，and fullscale constructed wetlands[J].Desalination and water treatment，2016，57（46）：21806-21816.
[11] 孫红英.人工湿地高氮水平下植物多样性对温室气体释放的效应及机制[D].杭州：浙江大学，2013.
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关键词 湿地；微生物群落；功能基因；脱氮；环境因素
中图分类号 S181 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0035-04
Abstract [Objective] To compare the potential capacity of denitrification in three typical wetlands and study the microbiology mechanism. [Method] Collecting samples in situ， to determine nitrogen removal capacity of substrate and study microbiological mechanism by means of qPCR and highthroughput sequencing analysis. [Result] YRD was more conducive to removing NO.-3， while DWR and XMR were more conducive to removing NH.+4. DWR had the highest copy of nobL， while there was no significant difference between YRD and XMR. YRD had the lowest copy of amoA. The relative abundance of βProteobacteria in DWR and XMR was the highest， while in YRD was γProteobacteria. Cyanobateria played an important role in DWR and XMR. [Conclusion] Although YRD has the lowest copy of denitrifying bacteria， the high abundance of γ Proteobacteria leads to strong denitrifying ability. DWR and XMR have more nitrifying and denitrifying bacteria， but the type of substrate is more conducive to nitrifying reaction.
Key words Wetland；Microflora；Function gene；Denitrification；Environmental factor
湿地是陆地生态系统和水生生态系统相互作用形成的独特的生态系统。湿地在种群、生态系统和全球生态3个不同等级尺度上都有重要的生态功能，被称为“生物超市”“文明的发源地”和“地球之肾”[1]。湿地有2种基本类型：天然湿地和人工湿地[2]。根据系统内的水力水流特性，人工湿地分为表流人工湿地和潜流人工湿地两大类[3]。表流湿地与自然湿地相似，在饱和土壤基质上有浅层水面覆盖流动（通常小于60 cm深）[4]，也是工程应用较多的一种湿地类型。
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不同湿地类型对氮去除效果差异较大。据报道，湿地通过氨化作用去除氮的量为0.004～0.530 g/（m.2·d），通过硝化作用去除氮的量為0.010～2.150 g/（m.2·d），通过反硝化作用去除氮的量为0.003～1.020 g/（m.2·d）[9]。按照湿地形态学分类，我国的湿地类型主要为自然湿地、人工湿地和河流湿地。笔者研究了3种湿地类型基质的潜在脱氮能力，利用荧光定量PCR和高通量测序技术解析了其微生物学机制，以期为工程中湿地类型的选择提供理论依据和科学支撑。
1 材料与方法
1.1 选址与采样
试验选取山东省内3处典型的湿地类型：①东营的黄河三角洲湿地（YRD，山东省最大的自然湿地），②蒙阴的东汶河湿地（DWR，人工湿地），③聊城的小湄河湿地（XMR，河流湿地）（图1）。采用梅花取样方法，每个湿地取3个土样（0～20 cm深），将收集的每个土样在除去根系和有机物后混合均匀，然后立即放入密闭的塑料袋中保鲜并转移到实验室，4 h内进行进一步的样品处理。 1.2 理化性质分析
取样时，分别使用温度计、pH计（PHS-3C）和溶解氧仪（HQ30d 53LEDTM，HACH，USA）测定温度、pH和溶解氧（DO）。使用1 mol/L的氯化钾溶液提取基质中NH.+4、NO.-3和NO2.-，测定其含量。另外，使用重铬酸钾氧化法确定土壤中的有机碳含量（TOC）。
1.3 潜在氮去除试验
转移5 g基质样品到100 mL经氩气冲洗过的玻璃瓶中，并加入50 mL氩气清洗过的去离子水。随后，将样品分成3组并进行不同的处理，分别是：①对照组，②添加NO.-3 组，③添加NH.+4组。将上述装有样品液的烧瓶放置于暗处，室温下培养24 h。在试验开始（加入氮源后0 h）和末尾（加入氮源后24 h）取水样分析系统中氮和有机物的转化。其中，水样经离心分离并过0.45 μm滤膜后测定样品中的NH.+4、NO.-3和NO.-2含量。
1.4 样品DNA分析
使用土壤DNA提取试剂盒（MoBio，USA）提取总群落DNA。DNA浓度和纯度用超微量分光光度计（Nano-Drop Technologies，USA）进行分析。选取amoA、AOA、amx、nobL、narG、nirK、nirS和nosZ进行qPCR，具体方法见参考文献[10]，所有的样品测量都设3个平行。每次qPCR试验都包含1个阴性对照。在上海源序生物科技有限公司（Shanghai，China）進行高通量测序。
2 结果与分析
2.1 湿地水质和基质的理化性质
3个湿地的温度相似。从表1可以看出，3个湿地上覆水pH为8～9，说明3个湿地都偏碱性。其中YRD的pH最大，碱性最强，其次是DWR。而3个湿地上覆水DO差异较大，DWR的DO最高（3.63 mg/L），而XMR的DO只有1.68 mg/L，可能是因为XMR和YRD的土壤为致密黏壤土，DWR为沙子，空隙比较大，利于基质中DO的传输[10]。3个湿地上覆水中，YRD的NH.+4、NO.-2、NO.-3和TOC浓度都是最低的，这与YRD是天然湿地，几乎没有污水排入有关。城市污水导致人工湿地中氮和TOC的浓度变高[11]。DWR中NH.+4、NO.-2、NO.-3浓度高于XMR，这是由于DWR用于净化污水处理厂出水，而XMR是河道湿地，植物种类繁多，能够摄取水中NH.+4、NO.-2和NO.-3等污染物[12]。DWR中TOC浓度略低于XMR，这可能是因为DO在DWR中的浓度比XMR高1.95 mg/L。与此同时，XMR湿地中植物较多，在秋末冬初会腐烂，进而导致XMR内的TOC浓度升高。水中较高的氮含量导致在基质中相应含量较高，比如DWR基质的NO.-3浓度最高，达1.59 mg/kg，然而在YRD和XMR中并未检测到NO.-3（表2）。这是由于DWR地表水中DO较高，抑制了反硝化细菌的作用，造成NO.-3浓度升高。在3个湿地基质中，NH.+4浓度与DO呈负相关，而NO.-2几乎无法检测到。这可能是因为湿地基质DO较低，从而抑制了硝化细菌的活性。
2.2 潜在氮去除试验结果
通过研究试验前后水样中氮浓度变化，可以确定不同类型湿地基质对氮的转化能力。从图2a可以看出，YRD和XMR对照组中氮的浓度几乎不变。而DWR中NO.-3的浓度从0.15 mg/L增加到0.86 mg/L，这可能是由于DWR基质中含有NO.-3释放的结果。从图2b可以看出，添加NO.-3后，YRD中NO.-3的浓度从5.86 mg/L降低到355 mg/L，而NO.-2的浓度从0.02 mg/L增加到0.85 mg/L，说明YRD中硝酸盐变为亚硝酸盐，这是反硝化的第一步[13]。而DWR和XMR中，添加NO.-3反应前后，NO.-3几乎没有变化，可能跟其本身NO.-3累积，而DO相对较高比例与反硝化反应的发生有关。从图2c可以看出，在添加NH.+4后，XMR的NH.+4浓度降低最多，达3.50 mg/L，硝酸盐和亚硝酸盐浓度分别增加了2.30 mg/L和0.70 mg/L。这可能是由于XMR发生了部分硝化反应。DWR的NH.+4浓度从4.80 mg/L下降到3.00 mg/L，而NO.-3浓度从0.41 mg/L提高到1.60 mg/L，表明发生了硝化过程[14]。虽然XMR中消耗的NH.+4量最多，但是在XMR中发现了NO.-2的积累，说明在XMR中硝化反应进行不彻底，这可能是由于XMR中DO浓度不足以进行完全硝化反应。而在YRD中，基本未检测到NH.+4浓度变化。
2.3 实时荧光定量PCR结果
图3a代表了反硝化过程相关基因，在3个湿地中narG和nosZ的拷贝数没有显著差异，而DWR与XMR中narG的拷贝数高于YRD。虽然YRD中反硝化细菌的数量比DWR中少，但在添加硝酸盐的试验中表明，YRD更容易进行反硝化。结果表明，与反硝化有关的功能基因的数量与湿地基质的反硝化有一定的关系，但并不绝对。反硝化受多种因素的影响，包括硝酸盐浓度、不同植物种类的残留、O2的缺失、反硝化剂的存在、覆水的存在等[15]。图3b显示DWR中的nobL拷贝数为1.2×10.11 copies/g，而在YRD与XMR中nobL拷贝数约为3.0×10.9 copies/g。这可能是因为DWR的DO浓度高于另外2个湿地，相对有利于硝化细菌的生长。通过比较3个不同的湿地厌氧氨氧化基因的拷贝数，发现YRD的AOA拷贝数（3.0×10.8 copies/g）低于DWR（4.0×10.9 copies/g）和XMR（3.5×10.9 copies/g）。
2.4 高通量测序结果
高通量测序结果表明，DWR、XMR和YRD底泥样品中的微生物群落结构存在明显差异。图4显示在门水平上，3个样品中相对丰度最高的2个菌种为变形菌门（Proteobacteria），分别为60.0%（DWR）、56.0%（XMR）和61.0%（YRD）；其次是拟杆菌门（Bacteroidetes），分别为12.0%（DWR）、21.0%（XMR）和20.0%（YRD）。此外，具有光合作用的蓝藻细菌（Cyanobateria）在DWR和XMR群落中也占据比较重要的地位，相对丰度分别为8.5%和67%，而该类光合细菌在YRD中的相对丰度仅有0.2%。图5a是样品群落中变形菌门的进一步分析结果，DWR和XMR中的主导变形菌为β-变形菌（β-Proteobacteria），而YRD中的主导变形菌为γ-Proteobacteria。图5b对拟杆菌门进行了进一步划分，从图中可以看出，3个样品群落中的主导菌种均为拟杆菌（Bacteroidia）和未定地位的拟杆菌（Bacteroidetes incertae sedis），但XMR样品中这2类菌种的相对丰度之和明显大于另外2个样品。结合图4与图5的分析可以得出结论：γ-变形菌（γ-Proteobacteria）导致了YRD中较好的反硝化能力[16]，而β-Proteobacteria和Cyanobateria造成了DWR和XMR较好的硝化能力[17-18]。 3 结论
虽然YRD中反硝化菌的数量最少，但是较低的DO和γ-Proteobacteria较高的丰度导致了反硝化能力较高；而DWR与XMR具有较多的硝化和反硝化细菌，但是较高的DO和β-Proteobacteria和Cyanobateria更有利于发生硝化反应。
参考文献
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