【摘 要】
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[目的]金黄色葡萄球菌是一种兼性病原体,可以编码多种抗生素抗性和免疫逃逸基因,并可导致严重感染,其对万古霉素等抗生素的敏感性降低通常与WalRK突变有关.辅助膜蛋白YycH和YycI对WalRK磷酸化具有正调节功能.对金黄色葡萄球菌的YycI基因进行生物信息学分析,并进行克隆和原核表达,为金黄色葡萄球菌耐药机制的研究提供参考数据.[方法]使用 Protparam、CDD、PSORT、SignalP-5.0、TMpred、NetPhos 3.1 Server、PSIPRED、SWISS-MODEL等在线生物
【机 构】
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宁波卫生职业技术学院医学技术学院,浙江宁波315100
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[目的]金黄色葡萄球菌是一种兼性病原体,可以编码多种抗生素抗性和免疫逃逸基因,并可导致严重感染,其对万古霉素等抗生素的敏感性降低通常与WalRK突变有关.辅助膜蛋白YycH和YycI对WalRK磷酸化具有正调节功能.对金黄色葡萄球菌的YycI基因进行生物信息学分析,并进行克隆和原核表达,为金黄色葡萄球菌耐药机制的研究提供参考数据.[方法]使用 Protparam、CDD、PSORT、SignalP-5.0、TMpred、NetPhos 3.1 Server、PSIPRED、SWISS-MODEL等在线生物信息软件,分析YycI蛋白的理化性质、保守结构域、亚细胞定位、跨膜区域、磷酸化修饰位点、二级结构和三维结构等.以基因组DNA为模板扩增YycI基因,扩增产物经酶切回收后与载体pET-32a(+)相连接,构建重组表达载体,将该重组载体转化大肠杆菌TG1,经菌落PCR鉴定后,增菌培养并抽提质粒,再转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]YycI蛋白由262个氨基酸残基组成,相对分子质量为29 831.74 Da,等电点为9.01,含31个负电荷氨基酸残基和36个正电荷氨基酸残基,分子式:C1326H2110N360O413S4,原子总数4 213个,是一种稳定的亲水蛋白质,定位于细胞膜上,第9～26位氨基酸残基形成一个典型的跨膜区,具有31个潜在的磷酸化修饰位点,二级结构中β折叠和无规卷曲占较大比例,三维结构与二级结构预测结果相符.成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-YycI,经IPTG诱导后成功表达了分子量为47.5 kDa的YycI重组蛋白.[结论]pET-32a(+)-YycI转化的BL21(DE3)经IPTG诱导后可以大量表达YycI重组蛋白.YycI蛋白为跨膜蛋白,含有4个α螺旋和14个β折叠.YycI蛋白的分析和成功表达为该蛋白功能的研究奠定了一定的基础.
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