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摘要[目的]确定白木香愈伤组织与叶片DNA的快速提取方法。[方法]用TE、ES1、ES2 3种提取液及相应的方法提取叶片和愈伤组织总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测提取产物，通过普通PCR及荧光定量PCR检查DNA的可用性，并将PCR产物经克隆测序验证。[结果]ES1法提取的叶片和愈伤DNA条带清晰，纯度较高；普通PCR和荧光定量PCR可扩增出200和600 bp左右的目的条带。ES2法提取液电泳不能检测到DNA条带，但PCR可扩增出愈伤组织200 bp左右目的条带。TE法得到的提取液检测不到DNA条带且PCR不能得到目的条带。[结论]ES1提取液及相应的提取方法可用于白木香愈伤和叶片DNA高通量快速提取，为沉香属植物种质研究和分子研究奠定基础。
关键词濒危南药；白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]；DNA快速提取；沉香；叶片；愈伤
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04194-03
Determination of the Qualified Rapid-DNA-Extraction Method from Callus or Leaves of Aquilaria sinensis
GAO Zhihui，WEI Jianhe et al（Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Science，Beijing 100193； Hainan Key Lab of SouthChina Medicine Resource Protection and Development，Hainan Branch of Institute of Medicinal Plant Development of Chinese Academy of Medical Science，Wanning，Hainan 571533）
Abstract[Objective] To determine the rapid DNA extraction method from calli or leaves of Aquilaria sinensis. [Method] We tested three methods （TE，ES1，ES2） used in Arabidopsis and rice for rapid DNA extraction from leaves and calli of A.sinensis. The extracted products were evaluated through agarose gel electrophoresis，PCR and realtime PCR reactions.The amplicons were further confirmed by clone and sequencing.[Result] The extraction method using solution ES1 could successfully isolate total DNA from leaves and calli of A.sinensis in 20 min：agarose gel electrophoresis showed clear binds.The DNA was qualified for PCR amplification of ～200 bp or ～600 bp sequences.The extracted product from calli using solution ES2 can also amplify the ～200 bp sequence，but failed to amplify the ～600 bp sequence.Other methods were failed to extract DNA and amplify any sequences.[Conclusion] The method using ES1 solution is qualified for rapid DNA isolation from A.sinensis for PCR amplification，which will lay a foundation for Aquilaria plants germplasm and molecular research.
Key wordsEndangered southChina medicine； Aquilaria sinensis； DNA rapid extraction； Agarwood； Leaves； Callus
白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]又稱土沉香，属瑞香科沉香属植物，为我国特有的热带及亚热带常绿乔木，是我国生产名贵芳香类药材沉香的唯一植物来源。由于沉香的高价值（目前特级沉香块国际成交价高达10 000美元/kg）且国际市场需求极大，长期以来白木香遭到掠夺式过度砍伐，其原始林已经基本破坏殆尽。1999年白木香被列为国家2级濒危保护植物并收载于《中国植物红皮书》。2000年白木香被世界自然保护联盟（IUCN）列入《世界自然保护联盟受威胁植物红色名录》[2]。2004年白木香列入了《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES，即华盛顿公约）附录，同时产于东南亚等各国生产沉香的沉香属所有植物均列入了该公约名录。沉香主要形成于白木香树干心材部位。然而，健康的白木香不能形成沉香，只有在受到伤害、病菌侵染等胁迫时才会合成沉香类化学成分，经过长时间积累后形成沉香[3-7]。为保护沉香资源，建立高效、稳定的结香技术体系满足市场需求，亟需利用现代生物技术和分子生物学研究手段寻找高效结香优良种质，解析清楚沉香诱导结香的分子机制，为建立高效结香技术提供依据和思路。其中DNA提取方法是分子研究的基础，传统的植物DNA提取方法如CTAB法[8]、SDS[9]法等虽可获得的DNA纯度较高、产量大，但往往程序繁琐，用时较长，加上一次提取样品量有限，不能满足种质鉴定和转基因植株等分子鉴定的需求。故而寻找一种快速有效的简易DNA提取方法十分必要。目前，已有拟南芥、水稻、小麦、番茄、油菜、柑橘、松树等多种植物开发建立了各自适用的快速DNA提取方法，以用于转基因检测以及SSR、ISSR等分子标记扩增[10-15]。笔者考察白木香愈伤组织与叶片DNA的快速提取方法，以期为白木香的进一步开发利用提供依据。 1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象。白木香叶片，取自中国医学科学院药用植物研究所温室种植的3年生白木香（A.sinensis）。
1.1.2主要仪器。天根电动组织研磨器和Sigma 114高速离心机，购自Sigma公司；Thermo CR3i高速冷冻离心机，购自Thermo公司；BioRad凝胶成像系统、BioRad PowerPac电泳仪、Biometra PCR仪和BioRad IQ5荧光定量PCR仪，均购自BioRad公司。
1.1.3主要试剂。SDS（十二烷基磺酸钠）、EDTA（乙二胺四乙酸）、Tris、NaCl、KCl和异丙醇，均购自北京化学试剂公司；SYBR Green荧光定量PCR酶、Extaq酶和pMD18TSimple载体，均购自宝生物公司；PCR产物回收试剂盒，购自天根生化公司。
1.1.4供试菌株。大肠杆菌感受态细胞，购自北京全式金公司。
1.2方法
注：泳道1～3为TE、ES1、ES2 3种方法提取白木香愈伤组织DNA进行扩增；泳道4～6为TE、ES1、ES2 3种方法提取白木香叶片DNA进行扩增；泳道7为Marker。
圖2不同方法提取DNA的PCR扩增结果图2表明，扩增愈伤组织TUA基因183 bp长度的片段，ES1方法和ES2方法均可得到扩增产物。而扩增叶片DNA中的TUA基因，只有ES1方法可得到扩增产物。经克隆和测序分析，这得到的3条片段均为正确条带。这个结果表明ES1方法可用于提取白木香愈伤组织和叶片的总DNA，该DNA可用于扩增较短片段DNA序列。ES2方法可用于提取白木香愈伤组织总DNA并扩增较短片段DNA序列。虽然ES2法所得的抽提混合物经琼脂糖电泳并不能检测到DNA条带，但由于ES2法包含一步热浴的步骤，可能通过该步骤可使部分蛋白变性，虽然混合物中仍含有变性蛋白，但部分核酸亦可释放出来，只是由于变性蛋白堵塞胶孔导致无法辨析目的DNA条带。但这种方法提出DNA的效果仍然有限，仅适用于提取愈伤组织DNA和小片段扩增。
对于较长片段的扩增效果如图2，采用所有方法得到的愈伤组织和叶片DNA，只有ES1法提取的DNA可扩增出593 bp长的AsS基因片段，其他方法均无法扩增出目的条带。条带的正确性也经过了测序检验。表明ES1方法提取的白木香愈伤组织和叶片的总DNA也可用于扩增较长片段DNA序列（600 bp）。PCR结果也显示用ES1方法提取的愈伤组织DNA扩增效果好于叶片DNA，可能是由于白木香愈伤组织中复杂的化学成分较少，扩增干扰较小。
图3表明，荧光定量PCR结果与普通PCR结果一致，对于TUA基因片段的扩增，ES1法提取的愈伤与叶片DNA以及ES2方法提取的愈伤DNA可扩增出具有相同的溶解峰的产物。对于AsS基因片段的扩增，ES1法得到的2种组织的DNA可以扩增出具有相同溶解峰的产物。进一步证实了前面的结果。同时也表明，ES1法提取的DNA可用于进行荧光定量PCR试验。注：A为ES1法提取的愈伤与叶片DNA扩增所得TUA基因片段和ES2法提取的愈伤DNA扩增所得TUA基因片段的溶解曲线；B为ES1法提取的愈伤与叶片DNA扩增所得AsS基因片段的溶解曲线。
图3不同方法提取DNA的荧光定量PCR的溶解曲线安徽农业科学2014年3结论与讨论
试验通过比较3种植物快速DNA提取方法确定了适用于白木香愈伤组织和叶片的快速DNA提取方法为：取20 mg愈伤组织或叶片，加入ES1提取缓冲液，使用电动组织研磨器研磨，离心取上清，异丙醇沉淀DNA，最后用超纯水溶解。该方法可于20 min内提取12份白木香愈伤和叶片DNA（提取份数依离心机转子情况而定），获得的DNA可用于分子种质鉴定等分子研究。试验不但确定了白木香愈伤组织和叶片快速提取DNA的最佳方法，也为沉香属植物快速提取DNA提供了参考。
参考文献
[1] ERSOON G A.Growing 'the wood of the gods'：agarwood production in southeast Asia[J].Smallholder Tree Growing for Rural Development and Environmental Services：Lessons from Asia，2008，5：245-262.
[2] OLDFIELD S，LUSTY C，MACKINVEN A.The world list of threatened Tree[M].Combridge，UK：World Conservation Press，1998.
[3] YAGURA T，SHIBAYAMA N，ITO M，et al.Three novel diepoxy tetrahydrochromones from agarwood artificially produced by intentional wounding[J].Tetrahedron Letters，2005，46：4395-4398.
[4] POJANAGAROON S，KAEWRAK C.Mechanical methods to stimulate aloes wood formation in Aquilaria crassna Pierre ex H.Lec.（Kritsana） trees[M].WOCMAP III：Conservation，Cultivation and Sustainable Use of MAPs，2005：161-166.
[5] ITOH T，TABATA Y，WIDJAJA E，et al.Structure and artificial induction of aloe wood[J].IAWA Journal，2002，23：466-467. [6] 戚树源，林立东，胡厚才.白木香中色酮类化合物的形成[J].中草药，2000，31（9）：658-659.
[7] 戚树源，林立东，叶勤法.沉香中苄基丙酮及其在黄绿墨耳真菌中的生物转化[J].生物工程学报，1998，14（4）：464-466.
[8] MAGUIRE T，COLLINS G，SEDGLEY M.A modified CTAB DNA extraction procedure for plants belonging to the family proteaceae[J].Plant Mol Biol Rep，1994，12 （2）：106-109.
[9] 杨丽，张俊环，孙浩元，等.基于改良SDS法的杏基因组DNA提取[J].中国农学通报，2008，24（4）：69-71.
[10] 刘鹏，邱晓东，郭智慧，等.小麦幼叶DNA快速提取新方法及SSR-PCR扩增[J].江苏农业科学，2011，39（4）：36-37.
[11] 许明，程祖锌，黄志伟，等.一种适于转基因水稻PCR检测的微量DNA快速提取法[J].生物技术通报，2010（3）：128-130.
[12] 王伟伟，朱长青，刘小花，等.番茄叶片基因组DNA快速制备技术及其在基于实时荧光定量PCR的转基因检测中的应用[J].遗传，2011，33（9）：1017-1022.
[13] 谢景梅，刘晓兰，曲存民，等.甘蓝型油菜成熟籽粒DNA快速提取方法探讨[J].作物杂志，2012（1）：17-21.
[14] 施维属，潘腾飞，钟凤林，等.柑橘基因组DNA快速提取及ISSRPCR扩增体系优化[J].生物技术通报，2009（10）：109-113.
[15] 李义良，赵奋成，张应中，等.适用于微卫星标记的湿地松、加勒比松DNA快速提取法[J].生物技術通报，2010（1）：83-86.
[16] 王兰，龙云铭，刘耀光.一种用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法[J].分子植物育种，2009，7（2）：425-428.
[17] 杨双，阮燕晔，樊金娟，等.一种简易的拟南芥幼苗微量DNA提取方法[J].沈阳农业大学学报，2005，36（1）：99-100.
[18] 邹华文，李翠花，王彩丽，等.拟南芥基因组DNA微量提取方法的改良[J].江苏农业科学，2011，39（6）：52-53.
[19] GAO Z H，WEI J H，YANG Y，et al.Selection of reference genes for studying stressrelated agarwood formation of Aquilaria sinensis[J].Plant Cell Rep，2012，31（9）：1759-1768.
[20] KUMETA Y，ITO M.Characterization of deltaguaiene synthases from cultured cells of Aquilaria， responsible for the formation of the sesquiterpenes in agarwood[J].Plant Physiol，2010，154（4）：1998-2007.
关键词濒危南药；白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]；DNA快速提取；沉香；叶片；愈伤
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04194-03
Determination of the Qualified Rapid-DNA-Extraction Method from Callus or Leaves of Aquilaria sinensis
GAO Zhihui，WEI Jianhe et al（Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Science，Beijing 100193； Hainan Key Lab of SouthChina Medicine Resource Protection and Development，Hainan Branch of Institute of Medicinal Plant Development of Chinese Academy of Medical Science，Wanning，Hainan 571533）
Abstract[Objective] To determine the rapid DNA extraction method from calli or leaves of Aquilaria sinensis. [Method] We tested three methods （TE，ES1，ES2） used in Arabidopsis and rice for rapid DNA extraction from leaves and calli of A.sinensis. The extracted products were evaluated through agarose gel electrophoresis，PCR and realtime PCR reactions.The amplicons were further confirmed by clone and sequencing.[Result] The extraction method using solution ES1 could successfully isolate total DNA from leaves and calli of A.sinensis in 20 min：agarose gel electrophoresis showed clear binds.The DNA was qualified for PCR amplification of ～200 bp or ～600 bp sequences.The extracted product from calli using solution ES2 can also amplify the ～200 bp sequence，but failed to amplify the ～600 bp sequence.Other methods were failed to extract DNA and amplify any sequences.[Conclusion] The method using ES1 solution is qualified for rapid DNA isolation from A.sinensis for PCR amplification，which will lay a foundation for Aquilaria plants germplasm and molecular research.
Key wordsEndangered southChina medicine； Aquilaria sinensis； DNA rapid extraction； Agarwood； Leaves； Callus
白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]又稱土沉香，属瑞香科沉香属植物，为我国特有的热带及亚热带常绿乔木，是我国生产名贵芳香类药材沉香的唯一植物来源。由于沉香的高价值（目前特级沉香块国际成交价高达10 000美元/kg）且国际市场需求极大，长期以来白木香遭到掠夺式过度砍伐，其原始林已经基本破坏殆尽。1999年白木香被列为国家2级濒危保护植物并收载于《中国植物红皮书》。2000年白木香被世界自然保护联盟（IUCN）列入《世界自然保护联盟受威胁植物红色名录》[2]。2004年白木香列入了《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES，即华盛顿公约）附录，同时产于东南亚等各国生产沉香的沉香属所有植物均列入了该公约名录。沉香主要形成于白木香树干心材部位。然而，健康的白木香不能形成沉香，只有在受到伤害、病菌侵染等胁迫时才会合成沉香类化学成分，经过长时间积累后形成沉香[3-7]。为保护沉香资源，建立高效、稳定的结香技术体系满足市场需求，亟需利用现代生物技术和分子生物学研究手段寻找高效结香优良种质，解析清楚沉香诱导结香的分子机制，为建立高效结香技术提供依据和思路。其中DNA提取方法是分子研究的基础，传统的植物DNA提取方法如CTAB法[8]、SDS[9]法等虽可获得的DNA纯度较高、产量大，但往往程序繁琐，用时较长，加上一次提取样品量有限，不能满足种质鉴定和转基因植株等分子鉴定的需求。故而寻找一种快速有效的简易DNA提取方法十分必要。目前，已有拟南芥、水稻、小麦、番茄、油菜、柑橘、松树等多种植物开发建立了各自适用的快速DNA提取方法，以用于转基因检测以及SSR、ISSR等分子标记扩增[10-15]。笔者考察白木香愈伤组织与叶片DNA的快速提取方法，以期为白木香的进一步开发利用提供依据。 1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象。白木香叶片，取自中国医学科学院药用植物研究所温室种植的3年生白木香（A.sinensis）。
1.1.2主要仪器。天根电动组织研磨器和Sigma 114高速离心机，购自Sigma公司；Thermo CR3i高速冷冻离心机，购自Thermo公司；BioRad凝胶成像系统、BioRad PowerPac电泳仪、Biometra PCR仪和BioRad IQ5荧光定量PCR仪，均购自BioRad公司。
1.1.3主要试剂。SDS（十二烷基磺酸钠）、EDTA（乙二胺四乙酸）、Tris、NaCl、KCl和异丙醇，均购自北京化学试剂公司；SYBR Green荧光定量PCR酶、Extaq酶和pMD18TSimple载体，均购自宝生物公司；PCR产物回收试剂盒，购自天根生化公司。
1.1.4供试菌株。大肠杆菌感受态细胞，购自北京全式金公司。
1.2方法
注：泳道1～3为TE、ES1、ES2 3种方法提取白木香愈伤组织DNA进行扩增；泳道4～6为TE、ES1、ES2 3种方法提取白木香叶片DNA进行扩增；泳道7为Marker。
圖2不同方法提取DNA的PCR扩增结果图2表明，扩增愈伤组织TUA基因183 bp长度的片段，ES1方法和ES2方法均可得到扩增产物。而扩增叶片DNA中的TUA基因，只有ES1方法可得到扩增产物。经克隆和测序分析，这得到的3条片段均为正确条带。这个结果表明ES1方法可用于提取白木香愈伤组织和叶片的总DNA，该DNA可用于扩增较短片段DNA序列。ES2方法可用于提取白木香愈伤组织总DNA并扩增较短片段DNA序列。虽然ES2法所得的抽提混合物经琼脂糖电泳并不能检测到DNA条带，但由于ES2法包含一步热浴的步骤，可能通过该步骤可使部分蛋白变性，虽然混合物中仍含有变性蛋白，但部分核酸亦可释放出来，只是由于变性蛋白堵塞胶孔导致无法辨析目的DNA条带。但这种方法提出DNA的效果仍然有限，仅适用于提取愈伤组织DNA和小片段扩增。
对于较长片段的扩增效果如图2，采用所有方法得到的愈伤组织和叶片DNA，只有ES1法提取的DNA可扩增出593 bp长的AsS基因片段，其他方法均无法扩增出目的条带。条带的正确性也经过了测序检验。表明ES1方法提取的白木香愈伤组织和叶片的总DNA也可用于扩增较长片段DNA序列（600 bp）。PCR结果也显示用ES1方法提取的愈伤组织DNA扩增效果好于叶片DNA，可能是由于白木香愈伤组织中复杂的化学成分较少，扩增干扰较小。
图3表明，荧光定量PCR结果与普通PCR结果一致，对于TUA基因片段的扩增，ES1法提取的愈伤与叶片DNA以及ES2方法提取的愈伤DNA可扩增出具有相同的溶解峰的产物。对于AsS基因片段的扩增，ES1法得到的2种组织的DNA可以扩增出具有相同溶解峰的产物。进一步证实了前面的结果。同时也表明，ES1法提取的DNA可用于进行荧光定量PCR试验。注：A为ES1法提取的愈伤与叶片DNA扩增所得TUA基因片段和ES2法提取的愈伤DNA扩增所得TUA基因片段的溶解曲线；B为ES1法提取的愈伤与叶片DNA扩增所得AsS基因片段的溶解曲线。
图3不同方法提取DNA的荧光定量PCR的溶解曲线安徽农业科学2014年3结论与讨论
试验通过比较3种植物快速DNA提取方法确定了适用于白木香愈伤组织和叶片的快速DNA提取方法为：取20 mg愈伤组织或叶片，加入ES1提取缓冲液，使用电动组织研磨器研磨，离心取上清，异丙醇沉淀DNA，最后用超纯水溶解。该方法可于20 min内提取12份白木香愈伤和叶片DNA（提取份数依离心机转子情况而定），获得的DNA可用于分子种质鉴定等分子研究。试验不但确定了白木香愈伤组织和叶片快速提取DNA的最佳方法，也为沉香属植物快速提取DNA提供了参考。
参考文献
[1] ERSOON G A.Growing 'the wood of the gods'：agarwood production in southeast Asia[J].Smallholder Tree Growing for Rural Development and Environmental Services：Lessons from Asia，2008，5：245-262.
[2] OLDFIELD S，LUSTY C，MACKINVEN A.The world list of threatened Tree[M].Combridge，UK：World Conservation Press，1998.
[3] YAGURA T，SHIBAYAMA N，ITO M，et al.Three novel diepoxy tetrahydrochromones from agarwood artificially produced by intentional wounding[J].Tetrahedron Letters，2005，46：4395-4398.
[4] POJANAGAROON S，KAEWRAK C.Mechanical methods to stimulate aloes wood formation in Aquilaria crassna Pierre ex H.Lec.（Kritsana） trees[M].WOCMAP III：Conservation，Cultivation and Sustainable Use of MAPs，2005：161-166.
[5] ITOH T，TABATA Y，WIDJAJA E，et al.Structure and artificial induction of aloe wood[J].IAWA Journal，2002，23：466-467. [6] 戚树源，林立东，胡厚才.白木香中色酮类化合物的形成[J].中草药，2000，31（9）：658-659.
[7] 戚树源，林立东，叶勤法.沉香中苄基丙酮及其在黄绿墨耳真菌中的生物转化[J].生物工程学报，1998，14（4）：464-466.
[8] MAGUIRE T，COLLINS G，SEDGLEY M.A modified CTAB DNA extraction procedure for plants belonging to the family proteaceae[J].Plant Mol Biol Rep，1994，12 （2）：106-109.
[9] 杨丽，张俊环，孙浩元，等.基于改良SDS法的杏基因组DNA提取[J].中国农学通报，2008，24（4）：69-71.
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[12] 王伟伟，朱长青，刘小花，等.番茄叶片基因组DNA快速制备技术及其在基于实时荧光定量PCR的转基因检测中的应用[J].遗传，2011，33（9）：1017-1022.
[13] 谢景梅，刘晓兰，曲存民，等.甘蓝型油菜成熟籽粒DNA快速提取方法探讨[J].作物杂志，2012（1）：17-21.
[14] 施维属，潘腾飞，钟凤林，等.柑橘基因组DNA快速提取及ISSRPCR扩增体系优化[J].生物技术通报，2009（10）：109-113.
[15] 李义良，赵奋成，张应中，等.适用于微卫星标记的湿地松、加勒比松DNA快速提取法[J].生物技術通报，2010（1）：83-86.
[16] 王兰，龙云铭，刘耀光.一种用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法[J].分子植物育种，2009，7（2）：425-428.
[17] 杨双，阮燕晔，樊金娟，等.一种简易的拟南芥幼苗微量DNA提取方法[J].沈阳农业大学学报，2005，36（1）：99-100.
[18] 邹华文，李翠花，王彩丽，等.拟南芥基因组DNA微量提取方法的改良[J].江苏农业科学，2011，39（6）：52-53.
[19] GAO Z H，WEI J H，YANG Y，et al.Selection of reference genes for studying stressrelated agarwood formation of Aquilaria sinensis[J].Plant Cell Rep，2012，31（9）：1759-1768.
[20] KUMETA Y，ITO M.Characterization of deltaguaiene synthases from cultured cells of Aquilaria， responsible for the formation of the sesquiterpenes in agarwood[J].Plant Physiol，2010，154（4）：1998-2007.