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摘要：采用RTPCR方法扩增并克隆了2013年湖南省水稻上发生的南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice blackstreaked dwarf virus，SRBSDV）S10片段的近全长序列，采用生物信息学软件Mega、RDP和DnaSP分析其编码的开放阅读框（open reading fragment，ORF）遗传多样性。结果表明：2013年湖南省15个SRBSDV分离物S10编码的ORF序列同源性在99.5%以上，不同分离物中存在3～30个突变位点，绝大部分的核酸突变为无义突变，没有发现可能的重组。在系统发育树上，15个分离物聚类为2个分支，其中湖南汉寿的10个分离物和永州的2个分离物（HuNyz12和HuNyz29）与我国浙江分离物聚为1个亚组、湖南永州的其他3个分离物与我国南部的云南、海南等及越南的分离物聚为1个亚组。系统发育结果表明，SRBSDV随传毒介体白背飞虱迁飞从我国南部向北部扩散。
关键词：南方水稻黑条矮缩病毒； 湖南分离物； 组分S10； 克隆与分析
中图分类号： S 435.111； S 434.41
文献标识码： A
南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice blackstreaked dwarf virus，SRBSDV）是近年来在我国南方稻区危害非常严重的病毒之一，属于呼肠孤病毒科（Reoviridae），斐济病毒属（Fijivirus）第2组的1个新种[1]。自2009年以来，由SRBSDV侵染引起的南方水稻黑条矮缩病，在我国南方稻区快速扩展危害，仅2010年，在我国南方稻区的发生面积就达到120多万hm2，稻谷损失达到2.32亿kg。湖南省2010年所有稻区均有SRBSDV危害，发生面积约53万hm2，造成严重的经济损失[2]。
SRBSDV由白背飞虱以持续性传毒方式进行传播，主要危害水稻、玉米等禾本科作物[3]。病毒、寄主以及传毒介体长期的互作过程中，均会发生相应的适应性改变[4]。研究表明，SRBSDV危害区域包括热带、亚热带和温带地区，这些地区的温度差异大，水稻品种也具有一定差异，这些因素都可能影响传毒介体和SRBSDV的适应性。SRBSDV的序列分析结果也表明，SRBSDV的组分S1～S6的序列可能存在重组[5]。
然而迄今为止的大多数研究都表明，组分S9和S10的序列中不存在重组[68]。仅Li等[9]研究表明，SRBSDV的S10组分中存在重组，且第550位置的密码子处于正选择压力下。组分S10编码病毒外壳蛋白，该蛋白对于病毒的传播扩散以及在寄主体内的运输非常重要，因此，研究组分S10编码蛋白的遗传变异，对于了解SRBSDV的进化、适应性具有非常重要的意义。
本研究选择2013年采集的湖南省水稻主产区具有典型症状或疑似症状的水稻样本，经RTPCR检测后，克隆了染病的水稻样本中SRBSDV的S10近全长序列，分析了S10编码的ORF序列的遗传多样性。
1 材料与方法
1.1 水稻样品和试剂
水稻样品于2013年采集自湖南省水稻主产区，水稻类型包括早稻、中稻和晚稻。采集的水稻样品包括疑似SRBSDV侵染（38份）和具有典型症状（茎秆上沿叶脉有白色瘤状物）（12份）的水稻，所有样本保存于-80 ℃。
Trizol试剂、一步法反转录试剂盒和PCR反应试剂购自TransGen（北京）。
1.2 总RNA抽提
水稻总RNA抽提采用Trizol法，具体步骤参考说明书。
1.3 水稻样本RTPCR检测
水稻样本RTPCR检测，参考Zhou等的方法[1]，以所提总RNA为模板，采用一步法反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，具体步骤参考说明书。然后进行PCR扩增（引物S10F：5′ CGCGTCATCTCAAAACTACAG3′，S10R：5′TTTGTCAGCATCTAAAGCGC3′）[1]，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.4 SRBSDV S10组分近全长序列克隆
根据GenBank （http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中SRBSDV S10全序列（JQ692581.1），采用Oligo7[10]设计3对引物，以RTPCR检测结果为阳性的水稻总RNA为模板，扩增目标片段包含SRBSDV S10的ORF及5′和3′部分非编码区，引物序列见表1，扩增片段的大小分别为716、719和845 bp。
1.5 序列测定与分析
所有PCR产物的序列测定委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成，测序获得的序列利用ntBLAST进行比对（http：∥blast.stva.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），利用ORFfinder（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）确定S10编码的ORF。序列联配、突变位点及系统发育树构建采用Mega 4.0软件[11]。重组分析采用RDP 4软件[12]，遗传稳定性分析采用DnaSP 5.01软件[13]。
2 结果与分析
2.1 水稻样品RTPCR检测
2013年采集的水稻样品（50份）经RTPCR检测表明，有24份样品扩增得到预期目的条带，其中12份具有典型症状的水稻样本均扩增得到预期目的条带。测序结果表明，目的条带与NCBI中其他SRBSDV分离物对应的序列同源性很高（>98%）。
2.2 SRBSDV S10序列克隆
以24份SRBSDV阳性水稻样品总RNA为模板，利用设计的3对特异性引物，进行RTPCR扩增，结果表明，设计的3对引物均能扩增出与预期大小一致的单一目的条带。 24份样品中有15份样品经测序成功获得3个目的条带的序列，其中S10编码的ORF序列登录信息见表2。
2.3 SRBSDV S10编码的ORF序列分析
2.3.1 突变位点分析
序列联配结果表明，SRBSDV的15个湖南分离物S10 的ORF核酸序列都具有数目不一的突变位点，其中以SRBSDVHuNhs 4的突变位点最多，有30个位点发生突变。S10编码ORF的序列推导蛋白的联配结果表明，仅有少量核苷酸突变位点，导致其编码的氨基酸突变。DnaSP软件分析结果也证实，15个湖南分离物S10 的ORF发生突变，并不会影响其遗传稳定性（数据未显示）。
S10 ORF的核酸序列的转换/颠换率为 k1=12.708 （嘌呤）和 k2=28.817 （嘧啶），整体转换/颠换偏差为 R=9.204， 序列变异偏好A/G 或C/T的转换（表3）。
2.3.2 重组分析
利用RDP 4软件的6种算法（RDP、Geneconv、3Seq、SiScan、Bootscan和Chimaera）对湖南15个SRBSDV分离物的S10 ORF进行了重组分析，结果表明，在S10的ORF中没有检测到重组现象。
2.3.3 系统发育分析
S10 ORF的序列同源性分析结果表明，湖南省15个分离物的序列同源性大于99.5%；与海南、湖北、广西、广东、江西、浙江、江苏、安徽、云南、山东和越南分离物的同源性大于99%；与重庆、福建和贵州分离物的序列同源性大于98%。S10 ORF的系统发育分析结果表明，15个湖南分离物的S10编码的ORF序列可分为2个亚组，湖南永州的3个分离物聚为亚组Ⅰ，大多数SRBSDV分离物为我国南部的分离物（海南HaiN、云南YN）和越南分离物；湖南汉寿的10个分离物和永州的2个分离物（HuNyz12和HuNyz29）聚为亚组Ⅱ，相对于亚组Ⅰ，该亚组的分离物大多数为我国北方分离物（浙江ZJ）。值得注意的是，在亚组Ⅱ中，还包含湖南永州的2个分离物（HuNyz12和HuNyz29）处于一个相对独立的分支。
系统发育分析的地区划分以北纬30o为分界线，湖南永州位于南部、汉寿位于北部。位于湖南最南部的永州市3个SRBSDV分离物，与我国南部稻区的分离物（海南HaiN、云南YN）和越南分离物聚为1个亚组；而位于湖南最北部的汉寿县的10个SRBSDV分离物和永州的2个分离物（HuNyz12和HuNyz29）聚为亚组Ⅱ，该亚组包含的SRBSDV的分离物大多数为我国北方分离物（浙江ZJ）。该结果表明，SRBSDV S10编码的ORF的序列具有一定的地域差异。值得注意的是，在亚组Ⅱ中，还包含湖南永州的2个分离物（HuNyz12和HuNyz29），处于一个相对独立的分支，该结果表明，湖南汉寿和永州的SRBSDV S10编码的ORF序列存在相关性，这2个分离物可能是联系亚组Ⅰ和亚组Ⅱ的“桥梁”。
系统发育树分析结果还表明，我国北部的SRBSDV分离物绝大多数聚在亚组Ⅱ，仅4个分离物聚在亚组Ⅰ，占亚组Ⅰ的9.7%；而我国南部SRBSDV分离物大部分聚在亚组Ⅰ，有8个聚在亚组Ⅱ，占亚组Ⅱ的29.6%；这表明我国南部的SRBSDV分离物的多样性高于北部。
3 讨论
SRBSDV仅由白背飞虱传播、扩散危害[3]，因此，现有的南方水稻黑条矮缩病毒的分离物有着高同源性和低变异度，揭示了南方水稻黑条矮缩病毒来源单一的特点[14]。湖南省15个SRBSDV分离物的S10 ORF同源性非常高（>99.5%），与其他研究报道的结果一致，并且这15个分离物与其他省份的SRBSDV的S10 ORF的同源性大于98%，表明湖南省的SRBSDV与其他省份的来源一致。然而，对于南方水稻黑条矮缩病毒的起源地，目前还没有直接的研究证据。
湖南省15个SRBSDVS10的ORF高度同源（>99.5%），与我国其他省份和越南分离物的同源性也非常高（>98%），然而，系统发育分析表明，湖南省15个SRBSDVS10的ORF可以分为2个亚组（图1），表明SRBSDV在湖南省的传播扩散过程中，也存在进化压力[4]。
系统发育分析结果还表明，湖南省SRBSDV 15个分离物的多样性，与我国其他地区SRBSDV的多样性趋势一致，均是南部SRBSDV分离物的多样性高于北部（图1）。而SRBSDV的传毒介体白背飞虱，研究表明，也是从东南亚和/或我国南部向北部迁飞[15]，该结果暗示，SRBSDV传播扩散与传播介体白背飞虱的迁移类似，也是从我国南部向北部迁移。这与白背飞虱是目前已知的SRBSDV唯一传毒介体的研究结论一致[3]。
在植物病毒的进化中，突变、重组、重排等发挥主要的作用，从而使病毒适应寄主、环境等因素的变化，增强致病性，有利于病毒的扩展危害[4]。对SRBSDV的研究表明，在S1、S2、S4、S5、S6中发现了重组现象[5]。然而，对绝大多数S10序列的突变、重组等研究表明，S10不存在重组现象[78]。仅Li等[9]利用生物学软件HYPHY发现SRBSDV的S10组分中存在重组，且第550位置的密码子处于正选择压力下，作者指出，该结论还有待进一步验证。本研究结论与大多数研究结论一致，表明湖南省分离物S10编码的ORF遗传非常稳定。然而，湖南省分离物S10编码的ORF也存在一些位点突变，虽然仅有3～5个位点导致氨基酸残基突变，但是，该结果暗示，湖南省分离物S10编码的ORF，在随白背飞虱迁入湖南后，因寄主、环境因素等的影响，也存在进化压力，这种进化是否对SRBSDV的群体产生影响、产生何种影响以及对病害的防控有何启示尚需进行跟踪监控和进一步的深入研究。
参考文献
[1] Zhou Guohui， Wen Jingjung， Cai Dejiang， et al. Southern rice blackstreaked dwarf virus： a new proposed Fijivirus species in the family Reoviridae [J]. Chinese Science Bulletin，2008，53（23）：36773685. [2] 张松柏，张德咏，刘勇，等.2009年造成湖南省水稻大面积矮缩的是南方水稻黑条矮缩病[J].植物保护，2010，36（4）：98100.
[3] 曹杨，潘峰，周倩，等.南方水稻黑条矮缩病毒介体昆虫白背飞虱的传毒特性[J].应用昆虫学报，2011，48（5）：13141320.
[4] SztubaSolinska J， Urbanowicz A， Figlerowicz M， et al. RNARNA recombination in plant virus replication and evolution[J]. Annual Review of Phytopathology， 2011， 49： 415443.
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[8] 崔亚， 朱俊子， 周倩，等. 水稻南方黑条矮缩病毒湖南鼎城株系S10片段的基因组序列分析[J]. 基因组学与应用生物学， 2012， 31（2）：160166.
[9] Li Yongqiang， Xia Zihao， Peng Jun， et al. Evidence of recombination and genetic diversity in Southern rice blackstreaked dwarf virus[J]. Archives of Virology， 2013， 158： 21472151.
[10]Rychlik W. OLIGO 7 primer analysis software[M]∥Yuryev A. Methods in molecular biology， Vol 402： PCR primer design. Totowa： Humana Press Inc， 2007： 3559.
[11]Tamura K， Dudley J， Nei M， et al. MEGA4： molecular evolutionary genetics analysis （MEGA） software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution， 2007， 24： 15961599.
[12]Cole J R， Wang Qiong， Fish J A， et al. Ribosomal database project： data and tools for high throughput rRNA analysis [J]. Nuclear Acids Research， 2014， 42： D633D642.
[13]Librado P， Rozas J. DnaSP v5： A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data [J]. Bioinformatics，2009，25：14511452.
[14]Cheng Zhaobang， Li Shuo， Gao Ruizhen， et al. Distribution and genetic diversity of Southern rice blackstreaked dwarf virus in China [J]. Virology Journal， 2013， 10： 307.
[15]翟保平，周国辉，陶小荣，等.稻飞虱暴发与南方水稻黑条矮缩病流行的宏观规律和微观机制[J].应用昆虫学报，2011，48（3）：480487.
关键词：南方水稻黑条矮缩病毒； 湖南分离物； 组分S10； 克隆与分析
中图分类号： S 435.111； S 434.41
文献标识码： A
南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice blackstreaked dwarf virus，SRBSDV）是近年来在我国南方稻区危害非常严重的病毒之一，属于呼肠孤病毒科（Reoviridae），斐济病毒属（Fijivirus）第2组的1个新种[1]。自2009年以来，由SRBSDV侵染引起的南方水稻黑条矮缩病，在我国南方稻区快速扩展危害，仅2010年，在我国南方稻区的发生面积就达到120多万hm2，稻谷损失达到2.32亿kg。湖南省2010年所有稻区均有SRBSDV危害，发生面积约53万hm2，造成严重的经济损失[2]。
SRBSDV由白背飞虱以持续性传毒方式进行传播，主要危害水稻、玉米等禾本科作物[3]。病毒、寄主以及传毒介体长期的互作过程中，均会发生相应的适应性改变[4]。研究表明，SRBSDV危害区域包括热带、亚热带和温带地区，这些地区的温度差异大，水稻品种也具有一定差异，这些因素都可能影响传毒介体和SRBSDV的适应性。SRBSDV的序列分析结果也表明，SRBSDV的组分S1～S6的序列可能存在重组[5]。
然而迄今为止的大多数研究都表明，组分S9和S10的序列中不存在重组[68]。仅Li等[9]研究表明，SRBSDV的S10组分中存在重组，且第550位置的密码子处于正选择压力下。组分S10编码病毒外壳蛋白，该蛋白对于病毒的传播扩散以及在寄主体内的运输非常重要，因此，研究组分S10编码蛋白的遗传变异，对于了解SRBSDV的进化、适应性具有非常重要的意义。
本研究选择2013年采集的湖南省水稻主产区具有典型症状或疑似症状的水稻样本，经RTPCR检测后，克隆了染病的水稻样本中SRBSDV的S10近全长序列，分析了S10编码的ORF序列的遗传多样性。
1 材料与方法
1.1 水稻样品和试剂
水稻样品于2013年采集自湖南省水稻主产区，水稻类型包括早稻、中稻和晚稻。采集的水稻样品包括疑似SRBSDV侵染（38份）和具有典型症状（茎秆上沿叶脉有白色瘤状物）（12份）的水稻，所有样本保存于-80 ℃。
Trizol试剂、一步法反转录试剂盒和PCR反应试剂购自TransGen（北京）。
1.2 总RNA抽提
水稻总RNA抽提采用Trizol法，具体步骤参考说明书。
1.3 水稻样本RTPCR检测
水稻样本RTPCR检测，参考Zhou等的方法[1]，以所提总RNA为模板，采用一步法反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，具体步骤参考说明书。然后进行PCR扩增（引物S10F：5′ CGCGTCATCTCAAAACTACAG3′，S10R：5′TTTGTCAGCATCTAAAGCGC3′）[1]，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.4 SRBSDV S10组分近全长序列克隆
根据GenBank （http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中SRBSDV S10全序列（JQ692581.1），采用Oligo7[10]设计3对引物，以RTPCR检测结果为阳性的水稻总RNA为模板，扩增目标片段包含SRBSDV S10的ORF及5′和3′部分非编码区，引物序列见表1，扩增片段的大小分别为716、719和845 bp。
1.5 序列测定与分析
所有PCR产物的序列测定委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成，测序获得的序列利用ntBLAST进行比对（http：∥blast.stva.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），利用ORFfinder（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）确定S10编码的ORF。序列联配、突变位点及系统发育树构建采用Mega 4.0软件[11]。重组分析采用RDP 4软件[12]，遗传稳定性分析采用DnaSP 5.01软件[13]。
2 结果与分析
2.1 水稻样品RTPCR检测
2013年采集的水稻样品（50份）经RTPCR检测表明，有24份样品扩增得到预期目的条带，其中12份具有典型症状的水稻样本均扩增得到预期目的条带。测序结果表明，目的条带与NCBI中其他SRBSDV分离物对应的序列同源性很高（>98%）。
2.2 SRBSDV S10序列克隆
以24份SRBSDV阳性水稻样品总RNA为模板，利用设计的3对特异性引物，进行RTPCR扩增，结果表明，设计的3对引物均能扩增出与预期大小一致的单一目的条带。 24份样品中有15份样品经测序成功获得3个目的条带的序列，其中S10编码的ORF序列登录信息见表2。
2.3 SRBSDV S10编码的ORF序列分析
2.3.1 突变位点分析
序列联配结果表明，SRBSDV的15个湖南分离物S10 的ORF核酸序列都具有数目不一的突变位点，其中以SRBSDVHuNhs 4的突变位点最多，有30个位点发生突变。S10编码ORF的序列推导蛋白的联配结果表明，仅有少量核苷酸突变位点，导致其编码的氨基酸突变。DnaSP软件分析结果也证实，15个湖南分离物S10 的ORF发生突变，并不会影响其遗传稳定性（数据未显示）。
S10 ORF的核酸序列的转换/颠换率为 k1=12.708 （嘌呤）和 k2=28.817 （嘧啶），整体转换/颠换偏差为 R=9.204， 序列变异偏好A/G 或C/T的转换（表3）。
2.3.2 重组分析
利用RDP 4软件的6种算法（RDP、Geneconv、3Seq、SiScan、Bootscan和Chimaera）对湖南15个SRBSDV分离物的S10 ORF进行了重组分析，结果表明，在S10的ORF中没有检测到重组现象。
2.3.3 系统发育分析
S10 ORF的序列同源性分析结果表明，湖南省15个分离物的序列同源性大于99.5%；与海南、湖北、广西、广东、江西、浙江、江苏、安徽、云南、山东和越南分离物的同源性大于99%；与重庆、福建和贵州分离物的序列同源性大于98%。S10 ORF的系统发育分析结果表明，15个湖南分离物的S10编码的ORF序列可分为2个亚组，湖南永州的3个分离物聚为亚组Ⅰ，大多数SRBSDV分离物为我国南部的分离物（海南HaiN、云南YN）和越南分离物；湖南汉寿的10个分离物和永州的2个分离物（HuNyz12和HuNyz29）聚为亚组Ⅱ，相对于亚组Ⅰ，该亚组的分离物大多数为我国北方分离物（浙江ZJ）。值得注意的是，在亚组Ⅱ中，还包含湖南永州的2个分离物（HuNyz12和HuNyz29）处于一个相对独立的分支。
系统发育分析的地区划分以北纬30o为分界线，湖南永州位于南部、汉寿位于北部。位于湖南最南部的永州市3个SRBSDV分离物，与我国南部稻区的分离物（海南HaiN、云南YN）和越南分离物聚为1个亚组；而位于湖南最北部的汉寿县的10个SRBSDV分离物和永州的2个分离物（HuNyz12和HuNyz29）聚为亚组Ⅱ，该亚组包含的SRBSDV的分离物大多数为我国北方分离物（浙江ZJ）。该结果表明，SRBSDV S10编码的ORF的序列具有一定的地域差异。值得注意的是，在亚组Ⅱ中，还包含湖南永州的2个分离物（HuNyz12和HuNyz29），处于一个相对独立的分支，该结果表明，湖南汉寿和永州的SRBSDV S10编码的ORF序列存在相关性，这2个分离物可能是联系亚组Ⅰ和亚组Ⅱ的“桥梁”。
系统发育树分析结果还表明，我国北部的SRBSDV分离物绝大多数聚在亚组Ⅱ，仅4个分离物聚在亚组Ⅰ，占亚组Ⅰ的9.7%；而我国南部SRBSDV分离物大部分聚在亚组Ⅰ，有8个聚在亚组Ⅱ，占亚组Ⅱ的29.6%；这表明我国南部的SRBSDV分离物的多样性高于北部。
3 讨论
SRBSDV仅由白背飞虱传播、扩散危害[3]，因此，现有的南方水稻黑条矮缩病毒的分离物有着高同源性和低变异度，揭示了南方水稻黑条矮缩病毒来源单一的特点[14]。湖南省15个SRBSDV分离物的S10 ORF同源性非常高（>99.5%），与其他研究报道的结果一致，并且这15个分离物与其他省份的SRBSDV的S10 ORF的同源性大于98%，表明湖南省的SRBSDV与其他省份的来源一致。然而，对于南方水稻黑条矮缩病毒的起源地，目前还没有直接的研究证据。
湖南省15个SRBSDVS10的ORF高度同源（>99.5%），与我国其他省份和越南分离物的同源性也非常高（>98%），然而，系统发育分析表明，湖南省15个SRBSDVS10的ORF可以分为2个亚组（图1），表明SRBSDV在湖南省的传播扩散过程中，也存在进化压力[4]。
系统发育分析结果还表明，湖南省SRBSDV 15个分离物的多样性，与我国其他地区SRBSDV的多样性趋势一致，均是南部SRBSDV分离物的多样性高于北部（图1）。而SRBSDV的传毒介体白背飞虱，研究表明，也是从东南亚和/或我国南部向北部迁飞[15]，该结果暗示，SRBSDV传播扩散与传播介体白背飞虱的迁移类似，也是从我国南部向北部迁移。这与白背飞虱是目前已知的SRBSDV唯一传毒介体的研究结论一致[3]。
在植物病毒的进化中，突变、重组、重排等发挥主要的作用，从而使病毒适应寄主、环境等因素的变化，增强致病性，有利于病毒的扩展危害[4]。对SRBSDV的研究表明，在S1、S2、S4、S5、S6中发现了重组现象[5]。然而，对绝大多数S10序列的突变、重组等研究表明，S10不存在重组现象[78]。仅Li等[9]利用生物学软件HYPHY发现SRBSDV的S10组分中存在重组，且第550位置的密码子处于正选择压力下，作者指出，该结论还有待进一步验证。本研究结论与大多数研究结论一致，表明湖南省分离物S10编码的ORF遗传非常稳定。然而，湖南省分离物S10编码的ORF也存在一些位点突变，虽然仅有3～5个位点导致氨基酸残基突变，但是，该结果暗示，湖南省分离物S10编码的ORF，在随白背飞虱迁入湖南后，因寄主、环境因素等的影响，也存在进化压力，这种进化是否对SRBSDV的群体产生影响、产生何种影响以及对病害的防控有何启示尚需进行跟踪监控和进一步的深入研究。
参考文献
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