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摘要
[目的] 為进一步拓展新型重组中性植酸酶的工业应用。[方法] 研究海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖等糖类及不同的金属离子对其稳定性的影响。[结果] 该突变植酸酶的稳定性强烈依赖Ca2+的存在。当CaCl2浓度为0.10 mol/L，90 °C加热10 min时，剩余活性约为原来的67.7%。同时，添加糖类对酶稳定性也起到较好的保护作用。当80 、85、90 °C受热10 min时，海藻糖呈现出最好的保护性能，加入0.8 mol/L 左右，可使剩余酶活分别是原来的84.3%、65.5%和48.3%，为未添加时的2.61、4.34和15.00倍。 此外，在80 ℃加热条件下，麦芽糖也表现出较好的保护作用，剩余活性是未添加时的2.51倍。但是，在更高温度下尤其是90 ℃时，植酸酶的活性几乎完全丧失。[结论] 该研究结果可为植酸酶在水产饲料加工中的进一步应用提供参考。
关键词中性植酸酶；稳定性；添加剂
中图分类号S188+.3；Q814文献标识码
A文章编号0517-6611（2014）06-01607-03
Abstract[Objective] The research aimed to further expand the industrial application of the new neutral phytase. [Method] The effects of trehalose maltose， sucrose， glucose and different metal ions on its stability were studied. [Result] The stability of the phytase strongly depended on the presence of Ca2+. The remained activity was about 67.7% of the original under the condition of CaCl2 0.10 mol/L and 90 ℃ heating for 10 min. Adding sugars to the phytase also played a significant role in the improvement of the stability. Trehalose presented the best protection by adding 0.8 mol/L trehalose at 80 ℃， 85 ℃ and 90 ℃ heating for 10 min. The remained activities were about 84.3%， 65.5% and 48.3% of the original， and were 2.61， 4.34 and 15.00 times of the nonadditive phytase， respectively. Maltose also showed pretty good protective role at 80 ℃. The remained activity was 2.51 time of nonadditive phytase. However， maltose lost protection role at higher temperatures of 90 ℃， and the phytase activity almost completely lost. [Conclusion]The study provided important information for further application of phytase in aquatic feed processing.
Key wordsNeutral phytase； Stability； Additive
植酸酶（Phytase）即肌醇六磷酸酶（Myoinositol hexaphoshate phosphohydrotase），是催化植酸及其植酸盐水解产生肌醇和磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称[1]。它是一种新型、绿色、环保的饲料用酶，对于提高饲料中磷的利用率、提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率及减轻因动物高磷粪便所导致的环境污染有着极其重要的意义[2]。目前，有关植酸酶的研究主要集中在酸性植酸酶上，但它不适用于消化道为中性的淡水鲤科鱼类和畜禽消化道中呈中性的部位[3-4]。中性植酸酶主要来源于芽孢杆菌，其酶促反应的pH有效作用范围在7.0～7.5之间，可以有效弥补酸性植酸酶的不足[5-9]。然而，中性植酸酶在应用过程中还存在一些问题，其中最突出的就是该酶在高温制粒杀菌工艺中活力损失较大，因此获得高热稳定性的中性植酸酶成为近年来的研究热点和难点。如何提高酶蛋白分子在液体状态下的稳定性是开发液体剂型成功的关键。有研究表明，糖类、多羟基醇类等与酶蛋白分子表面的-NH3、-OH或-COOH等基团相互作用，可以有效提高酶分子的稳定性[10-11]。当酶活性中心含有离子作为配位体时，盐类作为液体酶的添加剂也可以通过离子键起到稳定酶构象的作用[12-13]。
笔者前期已经从淀粉液化芽孢杆菌中克隆到新型中性植酸酶基因，构建了高效表达的重组菌[14-15]，并且运用基因工程的技术进行定点突点，获得突变酶活性显著增加，并已申请中国发明专利[16]。关于中性植酸酶的基因工程菌的构建及改造的研究也一直受到国内外科研人员的关注，已成功获得几种中性植酸酶的基因工程菌[17-21]。目前，对于化学添加剂对中性植酸酶热稳定性影响的研究还不够深入，其液体剂型的开发方面还处于起步阶段。为进一步拓展新型重组中性植酸酶的工业应用，笔者在前期获得的重组酶的基础上，研究糖类及不同的金属离子对新型重组中性植酸酶稳定性的影响，为高稳定中性植酸酶液体制剂的开发及工业应用奠定基础。 1材料与方法
1.1材料
海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、氯化镁、氯化钙、钼酸铵、三羟甲基氨基甲烷、偏钒酸铵、乙酸钠等，均为国产分析纯。植酸钠购于Sigma公司，蛋白纯化试剂盒购于康为世纪公司。重组中性植酸酶为实验室自制。
1.2方法
1.2.1重组中性植酸酶的纯化。
构建好的重组大肠杆菌经诱导表达，离心，收集菌体，超声破碎后取上清液。采用康为世纪NiAgarose 6xHis标签蛋白纯化，试剂盒在4 ℃下进行纯化，并透析[15]。
1.2.2中性植酸酶活性的测定。
2.1无保护剂时中性植酸酶的热稳定性
选取适量浓度的纯化的突变植酸酶，分别在75、80、85和90 ℃受热10 min，以未受热酶活为100%，测定其剩余酶活。由图1可知，酶受热温度越高，剩余酶活越低。在75、 80、85、90 ℃，中性植酸酶分别剩余78.3%、32.3%、15.1%和3.2%的活性。高温制粒和高温消毒是现代饲料工业中常见的加工工艺。从无添加剂的液体酶来看，在75 ℃下加热10 min，酶活性损失20%左右，温度升高到80 ℃以上时绝大部分中性植酸酶变性，活性损失达60%以上。因此，为了更好地发挥植酸酶的作用，通过添加一定的稳定剂对酶进行保护具有非常重要的意义。2.2糖类添加剂对重组中性植酸酶热稳定性的影响
2.2.1在75 ℃热处理条件下，添加不同糖类对酶热稳定性的影响。
由图2可知，添加不同糖类的中性植酸酶溶液在75 ℃受热10 min后，酶活性总体保持在初始活性的70%以上。在此条件下，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖的最适添加浓度为0.2 mol/L，植酸酶活性分别为初始活性的120.2%、1032%、99.0%和91.1%。剩余活性分别是未添加稳定剂植酸酶的1.54、1.32、1.26 和1.16倍。 从图2还可以看出，当葡萄糖和蔗糖的添加量超过0.2 mol/L时，植酸酶剩余活性急剧下降。与其他糖类相比，以海藻糖为稳定剂，在测试的浓度范围内均表现出较稳定的保护酶活性的效果。2.2.2在80 ℃热处理条件下，添加不同糖类对酶热稳定性的影响。
由图3可知，添加不同糖类的中性植酸酶溶液在80 ℃受热10 min后，酶活性总体保持在初始活性的50%以上。在此条件下，各种糖类对中性植酸酶的保护作用由大到小依次为海藻糖>麦芽糖>蔗糖>葡萄糖。在添加浓度为0.7～0.9 mol/L时，海藻糖、麦芽糖及蔗糖对酶活的保护作用随浓度的变化不明显，剩余酶活基本保持稳定。其中，海藻糖的最适浓度为0.8 mol/L，在此条件下植酸酶剩余活性达到最高，为84.3%。麦芽糖最适浓度为0.7 mol/L，植酸酶剩余活性为81.2%；蔗糖和葡萄糖最适浓度为09 mol/L，植酸酶剩余活性分别为71.5%和60.4%。在最适浓度下，添加稳定剂海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖后，剩余活性分别是未添加时的2.61、2.51、2.21和1.87倍。
2.2.3在85 ℃热处理条件下，添加不同糖类对酶热稳定性的影响。
由图4可知，添加不同糖类的中性植酸酶溶液在85 ℃条件下受热10 min后，各种糖类对中性植酸酶的保护作用大小顺序为海藻糖>蔗糖>葡萄糖>麦芽糖。 与80 ℃条件相比，海藻糖仍起到最好的保护作用，在最适浓度0.8 mol/L下中性植酸酶剩余活性最高，为65.5%。然而，麦芽糖的保护作用明显降低，蔗糖与麦芽糖在最适浓度0.8 mol/L时，剩余活性分别为54.0%和45.3%。而葡萄糖的最适浓度为09 mol/L，剩余活性为51%。在最适浓度下，添加稳定剂海藻糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖后，剩余活性分别是未添加时的434、3.58、3.38和3.0倍。
2.2.4在90 ℃热处理条件下，添加不同糖类对酶热稳定性的影响。
由图5可知，添加不同糖类的中性植酸酶溶液在90 ℃受热10 min后，即使添加稳定剂，中性植酸酶的剩余活性也在50%以下。在添加浓度超过0.8 mol/L的条件下，各种糖类对中性植酸酶的保护作用大小顺序为海藻糖>葡萄糖>蔗糖>麦芽糖。海藻糖的保护作用仍然明显，1.0 mol/L海藻糖能使中性植酸酶的剩余酶活达到48.3%。葡萄糖的最适浓度为0.9 mol/L，剩余活性为45.0%；蔗糖的最适浓度为0.8 mol/L，剩余活性为45.6%。当受热温度上升到90 ℃时，添加麦芽糖基本上没有保护作用，植酸酶几乎失去全部活性。在最适浓度下，添加稳定剂海藻糖、葡萄糖、蔗糖后，剩余活性分别是未添加时15.10、14.06和14.25倍。
42卷6期路国伟等化学添加剂对新型重组中性植酸酶稳定性的影响
酶热稳定性的影响。研究表明，该突变植酸酶的稳定性强烈依赖Ca2+的存在。当CaCl2浓度为0.10 mol/L，90 ℃加热的条件下，剩余活性约为原来的67.7%。与未添加热稳定剂的植酸酶相比，添加糖类等对酶的稳定性起到较大幅度的改善作用。这是因为在植酸酶饲料加工应用过程中，温度是一个重要参数。因此，研究过程中对不同温度下加入各种糖类的情况进行比较。在80、85、90 ℃受热条件下，海藻糖呈现出保护性能最好，加入0.8 mol/L 左右时可使剩余酶活分别为原来的84.3%、65.5%和48.3%；在75、80 ℃受热条件下，麦芽糖表现出较好的保护作用，但在更高温度下尤其是在90 ℃条件下麦芽糖失去保护作用，植酸酶活性几乎完全丧失。该研究结果为植酸酶的制剂开发及其在水产饲料加工中的进一步应用提供参考。
参考文献
[1]
SINGH B，KUNZE G，SATYANARAYANA T，et al.Developments in biochemical aspects and biotechnological applications of microbial phytases[J].Biotechnol Mol Biol Rev，2011，6（3）：69-87. [2] SHAMNA K S，RAJAMANIKANDAN K C P，KUMAR D J M，et al.Extracellular production of phytases by a native Bacillus subtilis strain [J].Annals of Biological Research，2012，3（2）：979-987.
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[目的] 為进一步拓展新型重组中性植酸酶的工业应用。[方法] 研究海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖等糖类及不同的金属离子对其稳定性的影响。[结果] 该突变植酸酶的稳定性强烈依赖Ca2+的存在。当CaCl2浓度为0.10 mol/L，90 °C加热10 min时，剩余活性约为原来的67.7%。同时，添加糖类对酶稳定性也起到较好的保护作用。当80 、85、90 °C受热10 min时，海藻糖呈现出最好的保护性能，加入0.8 mol/L 左右，可使剩余酶活分别是原来的84.3%、65.5%和48.3%，为未添加时的2.61、4.34和15.00倍。 此外，在80 ℃加热条件下，麦芽糖也表现出较好的保护作用，剩余活性是未添加时的2.51倍。但是，在更高温度下尤其是90 ℃时，植酸酶的活性几乎完全丧失。[结论] 该研究结果可为植酸酶在水产饲料加工中的进一步应用提供参考。
关键词中性植酸酶；稳定性；添加剂
中图分类号S188+.3；Q814文献标识码
A文章编号0517-6611（2014）06-01607-03
Abstract[Objective] The research aimed to further expand the industrial application of the new neutral phytase. [Method] The effects of trehalose maltose， sucrose， glucose and different metal ions on its stability were studied. [Result] The stability of the phytase strongly depended on the presence of Ca2+. The remained activity was about 67.7% of the original under the condition of CaCl2 0.10 mol/L and 90 ℃ heating for 10 min. Adding sugars to the phytase also played a significant role in the improvement of the stability. Trehalose presented the best protection by adding 0.8 mol/L trehalose at 80 ℃， 85 ℃ and 90 ℃ heating for 10 min. The remained activities were about 84.3%， 65.5% and 48.3% of the original， and were 2.61， 4.34 and 15.00 times of the nonadditive phytase， respectively. Maltose also showed pretty good protective role at 80 ℃. The remained activity was 2.51 time of nonadditive phytase. However， maltose lost protection role at higher temperatures of 90 ℃， and the phytase activity almost completely lost. [Conclusion]The study provided important information for further application of phytase in aquatic feed processing.
Key wordsNeutral phytase； Stability； Additive
植酸酶（Phytase）即肌醇六磷酸酶（Myoinositol hexaphoshate phosphohydrotase），是催化植酸及其植酸盐水解产生肌醇和磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称[1]。它是一种新型、绿色、环保的饲料用酶，对于提高饲料中磷的利用率、提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率及减轻因动物高磷粪便所导致的环境污染有着极其重要的意义[2]。目前，有关植酸酶的研究主要集中在酸性植酸酶上，但它不适用于消化道为中性的淡水鲤科鱼类和畜禽消化道中呈中性的部位[3-4]。中性植酸酶主要来源于芽孢杆菌，其酶促反应的pH有效作用范围在7.0～7.5之间，可以有效弥补酸性植酸酶的不足[5-9]。然而，中性植酸酶在应用过程中还存在一些问题，其中最突出的就是该酶在高温制粒杀菌工艺中活力损失较大，因此获得高热稳定性的中性植酸酶成为近年来的研究热点和难点。如何提高酶蛋白分子在液体状态下的稳定性是开发液体剂型成功的关键。有研究表明，糖类、多羟基醇类等与酶蛋白分子表面的-NH3、-OH或-COOH等基团相互作用，可以有效提高酶分子的稳定性[10-11]。当酶活性中心含有离子作为配位体时，盐类作为液体酶的添加剂也可以通过离子键起到稳定酶构象的作用[12-13]。
笔者前期已经从淀粉液化芽孢杆菌中克隆到新型中性植酸酶基因，构建了高效表达的重组菌[14-15]，并且运用基因工程的技术进行定点突点，获得突变酶活性显著增加，并已申请中国发明专利[16]。关于中性植酸酶的基因工程菌的构建及改造的研究也一直受到国内外科研人员的关注，已成功获得几种中性植酸酶的基因工程菌[17-21]。目前，对于化学添加剂对中性植酸酶热稳定性影响的研究还不够深入，其液体剂型的开发方面还处于起步阶段。为进一步拓展新型重组中性植酸酶的工业应用，笔者在前期获得的重组酶的基础上，研究糖类及不同的金属离子对新型重组中性植酸酶稳定性的影响，为高稳定中性植酸酶液体制剂的开发及工业应用奠定基础。 1材料与方法
1.1材料
海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、氯化镁、氯化钙、钼酸铵、三羟甲基氨基甲烷、偏钒酸铵、乙酸钠等，均为国产分析纯。植酸钠购于Sigma公司，蛋白纯化试剂盒购于康为世纪公司。重组中性植酸酶为实验室自制。
1.2方法
1.2.1重组中性植酸酶的纯化。
构建好的重组大肠杆菌经诱导表达，离心，收集菌体，超声破碎后取上清液。采用康为世纪NiAgarose 6xHis标签蛋白纯化，试剂盒在4 ℃下进行纯化，并透析[15]。
1.2.2中性植酸酶活性的测定。
2.1无保护剂时中性植酸酶的热稳定性
选取适量浓度的纯化的突变植酸酶，分别在75、80、85和90 ℃受热10 min，以未受热酶活为100%，测定其剩余酶活。由图1可知，酶受热温度越高，剩余酶活越低。在75、 80、85、90 ℃，中性植酸酶分别剩余78.3%、32.3%、15.1%和3.2%的活性。高温制粒和高温消毒是现代饲料工业中常见的加工工艺。从无添加剂的液体酶来看，在75 ℃下加热10 min，酶活性损失20%左右，温度升高到80 ℃以上时绝大部分中性植酸酶变性，活性损失达60%以上。因此，为了更好地发挥植酸酶的作用，通过添加一定的稳定剂对酶进行保护具有非常重要的意义。2.2糖类添加剂对重组中性植酸酶热稳定性的影响
2.2.1在75 ℃热处理条件下，添加不同糖类对酶热稳定性的影响。
由图2可知，添加不同糖类的中性植酸酶溶液在75 ℃受热10 min后，酶活性总体保持在初始活性的70%以上。在此条件下，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖的最适添加浓度为0.2 mol/L，植酸酶活性分别为初始活性的120.2%、1032%、99.0%和91.1%。剩余活性分别是未添加稳定剂植酸酶的1.54、1.32、1.26 和1.16倍。 从图2还可以看出，当葡萄糖和蔗糖的添加量超过0.2 mol/L时，植酸酶剩余活性急剧下降。与其他糖类相比，以海藻糖为稳定剂，在测试的浓度范围内均表现出较稳定的保护酶活性的效果。2.2.2在80 ℃热处理条件下，添加不同糖类对酶热稳定性的影响。
由图3可知，添加不同糖类的中性植酸酶溶液在80 ℃受热10 min后，酶活性总体保持在初始活性的50%以上。在此条件下，各种糖类对中性植酸酶的保护作用由大到小依次为海藻糖>麦芽糖>蔗糖>葡萄糖。在添加浓度为0.7～0.9 mol/L时，海藻糖、麦芽糖及蔗糖对酶活的保护作用随浓度的变化不明显，剩余酶活基本保持稳定。其中，海藻糖的最适浓度为0.8 mol/L，在此条件下植酸酶剩余活性达到最高，为84.3%。麦芽糖最适浓度为0.7 mol/L，植酸酶剩余活性为81.2%；蔗糖和葡萄糖最适浓度为09 mol/L，植酸酶剩余活性分别为71.5%和60.4%。在最适浓度下，添加稳定剂海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖后，剩余活性分别是未添加时的2.61、2.51、2.21和1.87倍。
2.2.3在85 ℃热处理条件下，添加不同糖类对酶热稳定性的影响。
由图4可知，添加不同糖类的中性植酸酶溶液在85 ℃条件下受热10 min后，各种糖类对中性植酸酶的保护作用大小顺序为海藻糖>蔗糖>葡萄糖>麦芽糖。 与80 ℃条件相比，海藻糖仍起到最好的保护作用，在最适浓度0.8 mol/L下中性植酸酶剩余活性最高，为65.5%。然而，麦芽糖的保护作用明显降低，蔗糖与麦芽糖在最适浓度0.8 mol/L时，剩余活性分别为54.0%和45.3%。而葡萄糖的最适浓度为09 mol/L，剩余活性为51%。在最适浓度下，添加稳定剂海藻糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖后，剩余活性分别是未添加时的434、3.58、3.38和3.0倍。
2.2.4在90 ℃热处理条件下，添加不同糖类对酶热稳定性的影响。
由图5可知，添加不同糖类的中性植酸酶溶液在90 ℃受热10 min后，即使添加稳定剂，中性植酸酶的剩余活性也在50%以下。在添加浓度超过0.8 mol/L的条件下，各种糖类对中性植酸酶的保护作用大小顺序为海藻糖>葡萄糖>蔗糖>麦芽糖。海藻糖的保护作用仍然明显，1.0 mol/L海藻糖能使中性植酸酶的剩余酶活达到48.3%。葡萄糖的最适浓度为0.9 mol/L，剩余活性为45.0%；蔗糖的最适浓度为0.8 mol/L，剩余活性为45.6%。当受热温度上升到90 ℃时，添加麦芽糖基本上没有保护作用，植酸酶几乎失去全部活性。在最适浓度下，添加稳定剂海藻糖、葡萄糖、蔗糖后，剩余活性分别是未添加时15.10、14.06和14.25倍。
42卷6期路国伟等化学添加剂对新型重组中性植酸酶稳定性的影响
酶热稳定性的影响。研究表明，该突变植酸酶的稳定性强烈依赖Ca2+的存在。当CaCl2浓度为0.10 mol/L，90 ℃加热的条件下，剩余活性约为原来的67.7%。与未添加热稳定剂的植酸酶相比，添加糖类等对酶的稳定性起到较大幅度的改善作用。这是因为在植酸酶饲料加工应用过程中，温度是一个重要参数。因此，研究过程中对不同温度下加入各种糖类的情况进行比较。在80、85、90 ℃受热条件下，海藻糖呈现出保护性能最好，加入0.8 mol/L 左右时可使剩余酶活分别为原来的84.3%、65.5%和48.3%；在75、80 ℃受热条件下，麦芽糖表现出较好的保护作用，但在更高温度下尤其是在90 ℃条件下麦芽糖失去保护作用，植酸酶活性几乎完全丧失。该研究结果为植酸酶的制剂开发及其在水产饲料加工中的进一步应用提供参考。
参考文献
[1]
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