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摘 要： 目的 对河南人群中D12S391基因座突变进行研究分析。方法 从河南事缘法医物证司法鉴定所2018-2020年期间1000个亲子鉴定案例中整理出家系进行分析，筛选存在等位基因突变案例，应用多重 PCR 扩增技术及毛细管电泳技术进行基因座分型，本DNA进行检测分析。 结果 在 D12S391基因座2000次传递中共出现69次突变，均为1个位点突变，突变发生的概率男性要大于女性。 结论 准确获得河南人群D12S391基因座的突变率，当出现疑似突变案例时应增加STR基因座的检测数量，并且在计算存在突变案例的 CPI 值时，应考虑不同的人群和地域间、性别的差异，以最大限度地降低误判风险。
关键词：亲权鉴定;D12S391基因座;突变分析;法医遗传学
河南人口众多，随着社会的高速发展，不同民族不同地域之间的联姻逐渐增加，导致了人口遗传信息分析的复杂性[1]。短串联重复序列（Short Tandem Repeat，STR）是目前法医物证中应用最广泛的遗传标记之一，具有高度多态性和遗传稳定性[2]。在遗传中也有可能发生基因突变的现象，因此，这给日常亲权鉴定工作带来了一定难度。 STR基因座突变，是等位基因从亲代向子代遗传过程中发生改变，表现为真实家系的STR基因座分型结果出现不符合遗传规律的现象[3]。D12S391基因座位位于人类第12号，具有复杂的核心序列结构，群体遗传学研究表明均具有高度的多态性，在法医学同一认定及亲子鉴定中具有较高的应用价值[4-5]。通过对实际案例中常染色STR 基因座突变情况的观察与分析，可以对亲子鉴定中突变问题的分析进行指导[6]，同时也能够为日常亲权鉴定工作及群体遗传学研究提供基础资料，帮助司法鉴定人在鉴定工作中更有效的判断突变的发生及注意回避特殊案例中存在的风险。
1. 對象与方法
1.1 研究对象
研究对象来自河南省事缘法医物证司法鉴定所2018-2020年委托我所进行亲权鉴定1000例。所有案例均为三联体家系，肯定亲权关系，并通过电话征求了当事人同意。每位当事人采集静脉血0. 5 mL，用 EDTA抗凝，置于-20℃冰箱冻存。
1.2 仪器及试剂
EX22和21+1荧光检测试剂盒（包括ReactionMix、Primers、Taq酶、Allelic Ladder、AGCU MarkerSIZ-500等）购自无锡中德美联生物技术有限公司;GoldenEye_20A系统荧光标记检测试剂盒（包括2.5×PCR Mix、21Plex Primers、Taq DNA聚合酶、PCR Grade Water、Orange-500等）购自江苏苏博医学科技南京有限公司。GeneAmp 9700热循环仪、3500型遗传分析仪等均来自美国应用生物系统公司。
1.3 PCR扩增和电泳分型
用Chelex-100法提取基因组DNA。PCR扩增体系和程序严格按照试剂盒说明书操作。每次扩增以阳性对照DNA作阳性对照，用纯水代替样本DNA作阴性对照。用ABI3500 型分析仪进行毛细管电泳和荧光检测，使用Gene Mapper v3.2 软件分析基因型。
1.4 统计学与突变分析
根据试剂盒提供的STR基因座的基因频率，当出现不符合遗传定律的基因座时用 AGCU Express marker22 荧光检测试剂盒验证突变真实性，用AGCU 21+1 STR试剂盒（无锡中德美联生物技术公司）补充STR位点，当补充位点均为符合情况时按照亲权鉴定技术规范——司法部《亲权鉴定技术规范》（GBT 37223—2018）和《法医物证鉴定 Y-STR 检验规范》（SF， Z JD0105007—2018）计算亲权指数（paternityindex， PI）、累积亲权指数（cumulative paternityindex， CPI），μ为平均突变率0.002。当 CPI≥104时，则确认不符合遗传定律的基因座为突变。
2. 结果
2.1常染色体D12S391基因座分型与频率
1000 例河南汉族无关个体在D12S391基因座共检测到16个等位基因。其中最常见的等位基因为 19（2135），最少见的等位基因有18.2、18.3、27。各等位基因及基因频率，见表 1
2.2 D12S391基因座分型结果
亲子鉴定案件运用GoldenEye_20A荧光系统检测20个基因座分型结果是否符合遗传规律。进一步采用EX22荧光检测试剂盒检测22个基因座进行复核验证突变的STR位点，发现基因座的分型与上述结果一致，其余均符合遗传规律（图1）。采用AGCU 21+1试剂盒进一步检测，共检测 21个STR基因座，其中D19S433为重复基因座，新增的20个多态性STR基因座均符合遗传规律。
2.3 D12S391基因座突变分析
根据人类遗传规律，孩子的遗传基因必然来自亲生父母双方。本案例D12S391基因座的突变来源于父亲。在发现的69例突变中不同等位基因突变的概率见表2。
3. 讨论
STR基因座突变与遗传多态性程度有着一定的关系，对其发生突变机制的共识是DNA 复制滑动（replication slippage）[7]。表现为STR基因座等位基因重复单位的减少或增加，从而使新合成的DNA链减少或增加一至多个基序，对应则被称为一步突变或多步突变[8-9]。扩增片段较大的STR基因座更容易发生突变，这可能是由于重复单位多的基因座其长度也较长，必然多态性程度也较高，其突变概率会随之增加[10]。
司法鉴定技术规范要求累计亲权指 数大于10000时支持被检测男子（或被检测女子）是孩子生物学父亲（或母亲），累计亲权指数小于 0.0001支持被检测男子（或被检测女子）不是孩子生物学父亲（或母亲）[11]。所谓的突变均是建立于在认定亲权关系的假设上。如果只有 1～2 个基因座不符合遗传规律，累计亲权指数在0.0001～10000之间应增加检测其他高度多态性且遗传稳定的STR基因座，以避免由于STR基因座突变导致错误地排除亲权关系[12]。 STR 基因座突变存在性别差异，通常男性突变生概率高于女性[13]。本研究结果显示，突变来源有明显性别差异，父源突变与母源突变的比例为9：1，这与文献报道一致[14]。本研究1000例案例中D12S391基因座突变有69例，均为1步突变。随着二代测序技术的发展，在实验室条件允许的情况下，还可以进行二代测序，新一代测序应用于法医 DNA分析的有很大的优势。它能够分辨长度相同、但碱基序列不同的等位基因。通过检测突变位点的碱基序列，从而判断其变异的真实性。
因此，我们在进行亲子鉴定时， 运用多种该技术手段进行验证，提高准确率，并选用突变率低、多态信息含量相对较高的STR位点。在进行个体识别时，可选用突变率高的STR 位点如D12S391， 这样会减少在分析结果时碰到困难的机会。
参考文献
1. 陈春宝， 苏震， 田昕， 吴汉花， 王洁. 海南汉族人群19个STR基因座遗传多态性及其应用. 中国法医学杂志 2017， 32（03）： 276-280.
2. 康冰， 王鑫， 吴东， 王红丹， 何淼， 苏俊祥， et al. 河南汉族人群21个常染色体短串联重复序列基因座的遗传多态性检测. 郑州大学学报（医学版） 2020， 55（03）： 430-434.
3. 周冰燚， 徐珊珊， 顾恒， 李铭臻， 郑立新. 亲子鉴定案件中21个STR基因座的突变分析. 中国医药导报 2021， 18（02）： 20-22.
4. 李海玉， 冉娜， 张巧英， 丁志囡， 范光耀. 1例亲子鉴定中D12S391基因座等位基因“缺失”的分析. 中国法医学杂志 2019， 34（06）： 611-612.
5. 赖力， 薛士杰， 金静君， 何萍. 福建汉、畲族D6S1043和D12S391基因座遗传多态性. 中国法医学杂志 2011， 26（03）： 222-223.
6. 王宋兴， 庞敬博， 张茵， 杨璐瑜， 何柳媚， 李桢， et al. 广东汉族人群21个常染色体STR基因座遗传多态性. 中国输血杂志 2019， 32（5）： 438-442.
7. 陈启华， 蒋劲鹏， 陈莹. 广东肇庆汉族人群20个常染色体STR基因座突变分析. 中国司法鉴定 2019（02）： 37-39.
8. 何文谊. 亲子鉴定中STR基因座PentaD三步突变分析1例. 医学信息 2019， 32（21）： 186.
9. 赵佩翔. 贵州省汉族亲子鉴定中23个常染色体STR基因座的多态性及突变分析. 硕士， 遵义医科大学， 2019.
10. 武红艳， 张林， 陈璐， 樊爱英， 王克杰. D19S433稀有等位基因的确认和判读2例. 中国法医学杂志 2018， 33（02）： 207-209.
11. 窦永恒， 王润波， 张静， 王海丽. 亲权鉴定基因座两步突变分析. 生物化工 2021， 7（01）： 48-51.
12. 王海丽， 周世媛， 王凤羽， 周继苹， 窦永恒. 河南汉族人群Penta E基因座的群体遗传学与法医学应用评价. 医疗装备 2016， 29（07）： 37-38.
13. 徐冬冬， 王韵， 杨慧凌， 杜冰. 亲子鉴定中Penta E突变1例. 中国法医学杂志 2020， 35（04）： 444-445.
14. 劉玉梅. 942例亲子鉴定案例中STR基因座突变的观察和分析. 亚洲临床医学杂志 2020，3（03）
河南省生殖健康科学技术研究院 河事缘法医物证司法鉴定所 河南郑州 450003
关键词：亲权鉴定;D12S391基因座;突变分析;法医遗传学
河南人口众多，随着社会的高速发展，不同民族不同地域之间的联姻逐渐增加，导致了人口遗传信息分析的复杂性[1]。短串联重复序列（Short Tandem Repeat，STR）是目前法医物证中应用最广泛的遗传标记之一，具有高度多态性和遗传稳定性[2]。在遗传中也有可能发生基因突变的现象，因此，这给日常亲权鉴定工作带来了一定难度。 STR基因座突变，是等位基因从亲代向子代遗传过程中发生改变，表现为真实家系的STR基因座分型结果出现不符合遗传规律的现象[3]。D12S391基因座位位于人类第12号，具有复杂的核心序列结构，群体遗传学研究表明均具有高度的多态性，在法医学同一认定及亲子鉴定中具有较高的应用价值[4-5]。通过对实际案例中常染色STR 基因座突变情况的观察与分析，可以对亲子鉴定中突变问题的分析进行指导[6]，同时也能够为日常亲权鉴定工作及群体遗传学研究提供基础资料，帮助司法鉴定人在鉴定工作中更有效的判断突变的发生及注意回避特殊案例中存在的风险。
1. 對象与方法
1.1 研究对象
研究对象来自河南省事缘法医物证司法鉴定所2018-2020年委托我所进行亲权鉴定1000例。所有案例均为三联体家系，肯定亲权关系，并通过电话征求了当事人同意。每位当事人采集静脉血0. 5 mL，用 EDTA抗凝，置于-20℃冰箱冻存。
1.2 仪器及试剂
EX22和21+1荧光检测试剂盒（包括ReactionMix、Primers、Taq酶、Allelic Ladder、AGCU MarkerSIZ-500等）购自无锡中德美联生物技术有限公司;GoldenEye_20A系统荧光标记检测试剂盒（包括2.5×PCR Mix、21Plex Primers、Taq DNA聚合酶、PCR Grade Water、Orange-500等）购自江苏苏博医学科技南京有限公司。GeneAmp 9700热循环仪、3500型遗传分析仪等均来自美国应用生物系统公司。
1.3 PCR扩增和电泳分型
用Chelex-100法提取基因组DNA。PCR扩增体系和程序严格按照试剂盒说明书操作。每次扩增以阳性对照DNA作阳性对照，用纯水代替样本DNA作阴性对照。用ABI3500 型分析仪进行毛细管电泳和荧光检测，使用Gene Mapper v3.2 软件分析基因型。
1.4 统计学与突变分析
根据试剂盒提供的STR基因座的基因频率，当出现不符合遗传定律的基因座时用 AGCU Express marker22 荧光检测试剂盒验证突变真实性，用AGCU 21+1 STR试剂盒（无锡中德美联生物技术公司）补充STR位点，当补充位点均为符合情况时按照亲权鉴定技术规范——司法部《亲权鉴定技术规范》（GBT 37223—2018）和《法医物证鉴定 Y-STR 检验规范》（SF， Z JD0105007—2018）计算亲权指数（paternityindex， PI）、累积亲权指数（cumulative paternityindex， CPI），μ为平均突变率0.002。当 CPI≥104时，则确认不符合遗传定律的基因座为突变。
2. 结果
2.1常染色体D12S391基因座分型与频率
1000 例河南汉族无关个体在D12S391基因座共检测到16个等位基因。其中最常见的等位基因为 19（2135），最少见的等位基因有18.2、18.3、27。各等位基因及基因频率，见表 1
2.2 D12S391基因座分型结果
亲子鉴定案件运用GoldenEye_20A荧光系统检测20个基因座分型结果是否符合遗传规律。进一步采用EX22荧光检测试剂盒检测22个基因座进行复核验证突变的STR位点，发现基因座的分型与上述结果一致，其余均符合遗传规律（图1）。采用AGCU 21+1试剂盒进一步检测，共检测 21个STR基因座，其中D19S433为重复基因座，新增的20个多态性STR基因座均符合遗传规律。
2.3 D12S391基因座突变分析
根据人类遗传规律，孩子的遗传基因必然来自亲生父母双方。本案例D12S391基因座的突变来源于父亲。在发现的69例突变中不同等位基因突变的概率见表2。
3. 讨论
STR基因座突变与遗传多态性程度有着一定的关系，对其发生突变机制的共识是DNA 复制滑动（replication slippage）[7]。表现为STR基因座等位基因重复单位的减少或增加，从而使新合成的DNA链减少或增加一至多个基序，对应则被称为一步突变或多步突变[8-9]。扩增片段较大的STR基因座更容易发生突变，这可能是由于重复单位多的基因座其长度也较长，必然多态性程度也较高，其突变概率会随之增加[10]。
司法鉴定技术规范要求累计亲权指 数大于10000时支持被检测男子（或被检测女子）是孩子生物学父亲（或母亲），累计亲权指数小于 0.0001支持被检测男子（或被检测女子）不是孩子生物学父亲（或母亲）[11]。所谓的突变均是建立于在认定亲权关系的假设上。如果只有 1～2 个基因座不符合遗传规律，累计亲权指数在0.0001～10000之间应增加检测其他高度多态性且遗传稳定的STR基因座，以避免由于STR基因座突变导致错误地排除亲权关系[12]。 STR 基因座突变存在性别差异，通常男性突变生概率高于女性[13]。本研究结果显示，突变来源有明显性别差异，父源突变与母源突变的比例为9：1，这与文献报道一致[14]。本研究1000例案例中D12S391基因座突变有69例，均为1步突变。随着二代测序技术的发展，在实验室条件允许的情况下，还可以进行二代测序，新一代测序应用于法医 DNA分析的有很大的优势。它能够分辨长度相同、但碱基序列不同的等位基因。通过检测突变位点的碱基序列，从而判断其变异的真实性。
因此，我们在进行亲子鉴定时， 运用多种该技术手段进行验证，提高准确率，并选用突变率低、多态信息含量相对较高的STR位点。在进行个体识别时，可选用突变率高的STR 位点如D12S391， 这样会减少在分析结果时碰到困难的机会。
参考文献
1. 陈春宝， 苏震， 田昕， 吴汉花， 王洁. 海南汉族人群19个STR基因座遗传多态性及其应用. 中国法医学杂志 2017， 32（03）： 276-280.
2. 康冰， 王鑫， 吴东， 王红丹， 何淼， 苏俊祥， et al. 河南汉族人群21个常染色体短串联重复序列基因座的遗传多态性检测. 郑州大学学报（医学版） 2020， 55（03）： 430-434.
3. 周冰燚， 徐珊珊， 顾恒， 李铭臻， 郑立新. 亲子鉴定案件中21个STR基因座的突变分析. 中国医药导报 2021， 18（02）： 20-22.
4. 李海玉， 冉娜， 张巧英， 丁志囡， 范光耀. 1例亲子鉴定中D12S391基因座等位基因“缺失”的分析. 中国法医学杂志 2019， 34（06）： 611-612.
5. 赖力， 薛士杰， 金静君， 何萍. 福建汉、畲族D6S1043和D12S391基因座遗传多态性. 中国法医学杂志 2011， 26（03）： 222-223.
6. 王宋兴， 庞敬博， 张茵， 杨璐瑜， 何柳媚， 李桢， et al. 广东汉族人群21个常染色体STR基因座遗传多态性. 中国输血杂志 2019， 32（5）： 438-442.
7. 陈启华， 蒋劲鹏， 陈莹. 广东肇庆汉族人群20个常染色体STR基因座突变分析. 中国司法鉴定 2019（02）： 37-39.
8. 何文谊. 亲子鉴定中STR基因座PentaD三步突变分析1例. 医学信息 2019， 32（21）： 186.
9. 赵佩翔. 贵州省汉族亲子鉴定中23个常染色体STR基因座的多态性及突变分析. 硕士， 遵义医科大学， 2019.
10. 武红艳， 张林， 陈璐， 樊爱英， 王克杰. D19S433稀有等位基因的确认和判读2例. 中国法医学杂志 2018， 33（02）： 207-209.
11. 窦永恒， 王润波， 张静， 王海丽. 亲权鉴定基因座两步突变分析. 生物化工 2021， 7（01）： 48-51.
12. 王海丽， 周世媛， 王凤羽， 周继苹， 窦永恒. 河南汉族人群Penta E基因座的群体遗传学与法医学应用评价. 医疗装备 2016， 29（07）： 37-38.
13. 徐冬冬， 王韵， 杨慧凌， 杜冰. 亲子鉴定中Penta E突变1例. 中国法医学杂志 2020， 35（04）： 444-445.
14. 劉玉梅. 942例亲子鉴定案例中STR基因座突变的观察和分析. 亚洲临床医学杂志 2020，3（03）
河南省生殖健康科学技术研究院 河事缘法医物证司法鉴定所 河南郑州 450003