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摘要： 目的： 检测不同时间点AMD3100对人肝癌HepG2细胞增殖及其与甲胎蛋白（alpha fetoprotein， AFP）表达的影响并探讨其意义。方法： MTT 法检测不同时间AMD3100对人肝癌细胞HepG2增殖的影响； Western blott分析不同时间点AMD3100对AFP表达的影响；结果： AMD3100对人肝癌HepG2细胞的抑制率在36h、48h、72h分别为35.2%、44.3%和56.3%，P<0.05；HepG2细胞AFP的表达减少，在36h、48h有显著性差异。这两方面的作用有时间依赖性；结论： AMD3100对HepG2细胞的增殖有抑制作用呈时间依赖性，这种抑制作用与抑制CXCR4信号轴有关，还可能与AFP的表达有关。
关键词： AMD3100；甲胎蛋白；肝癌细胞；癌细胞增殖；CXCR4
【中图分类号】R749.053【文献标识码】B【文章编号】1672-8602（2014）07-0152-02
基金项目： 国家自然科学基金项目（30960153）；2013年海南省教育厅重点项目（Hjkj2013-27）
AMD3100是趋化因子受体CXCR4（ CXC chemokine receptor 4，CXCR4）特异性阻断剂，是一种小分子非肽类抑制剂，是桥联 1，4，8，11-四氮杂环十四烷，它在治疗肿瘤、HIV 感染、炎性疾病和干细胞动员中具有很强的应用潜力[1]。AFP是早期诊断肝细胞癌的特异性标志物，具有促进人肝癌细胞的增殖作用[2，3]。本研究应用AMD3100作用于人肝癌HepG2细胞，观察其在不同时间点对HepG2细胞生长的影响及其与AFP表达的关系。
1 材料与方法
1.1实验材料
人肝癌细胞株HepG2（北京大学医学部提供），兔抗人AFP抗体， CXCR4抗体，β-actin 抗体，辣根标记的羊抗兔IgG均购买于Stanta Cruz（America）公司；AMD3100（Sigma，America），DMEM高糖培养基，MTT（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide），96、6孔板均购自美国Gibco公司。优质胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；蛋白质印记marker（北京全式金生物技术有限公司）；硝酸纤维素膜（BioRad，America）。
1.2方法
1.2.1 MTT法检测不同时间AMD3100对细胞增殖的影响
用含有10%胎牛血清的DMEM培养HepG2细胞，分别以合适的密度接种于96孔板（12h组1.0×105个/ml；24h组及36h组5.0×104个/ml；48h组3.0×104个/ml；72h组2.0×104个/ml），100μl/孔，每组设6个平行孔。培养24h后，更换新的培养液，100μl/孔。对照组不处理，加药组加入AMD3100至终浓度为1.5μg/ml，对照组加入与加药组同体积的H2O（因AMD3100溶于水）。分别在细胞培养12h，24h，36h，48h，72h后，每孔加入20μlMTT，37℃孵育4h。去掉所有的液体，加入100μl/孔二甲基亚砜，微量振荡仪振荡10min，自动酶标仪（Bio-TEK Instruments.Inc）在490nm波长测吸光值。细胞增殖抑制率=（对照组OD-实验组OD）/ 对照组OD。
1.2.2 Western blot检测不同时间点AMD3100对AFP表达的影响。
将HepG2细胞按合适的密度（12h组1.0×105个/ml；24h组及36h组5.0×104个/ml；48h组3.0×104个/ml），接种于6孔板中，每组设3个重复平行孔，加入到含10%胎牛血清的DMEM培养，24h后，对照组不处理，加药组分别加入AMD3100至终浓度为1.5μg /ml培养细胞。分别在细胞培养0h，12h，24h，36h，48h后，收取细胞，提取蛋白，定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳，再把蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素（NC）膜，进行抗原-抗体结合反应，用化学发光仪（LAS3000）（FUJI，Japan）检测细胞AFP表达的变化，具体操作按文献[6]方法进行。
1.2.6 统计学处理 应用统计学软件SPSS11.5对数据进行t-test，P﹤0.05具有统计学意义，P﹤0.01具有显著统计学意义。
2 结果
2.1 AMD3100对HepG2细胞增殖的抑制作用
MTT结果表明，在12h，24h，AMD3100对HepG2细胞的增殖没有显著性影响，在36h，48h和72h，AMD3100对HepG2细胞增殖抑制率分别为 35.2%，44.3%和56.3%，和对组比较有显著性差异，呈时间依赖性，P<0.01（见图1）。
图1.不同的时间点AMD3100对HepG2细胞增殖的抑制作用
AMD3100（1.5 g/ml）处理HepG2细胞，分别在12h，24h，36h，48h，72h，用MTT法检测并计算其抑制率。和对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
2.2 不同用药时间点AMD3100对HepG2细胞AFP表达的影响
Western blot结果表明，用浓度为1.5 g/ml的AMD3100处理HepG2细胞，在12h，24h，HepG2细胞表达AFP没有显著性变化，在36h、48h，HepG2细胞表达AFP显著减少，呈时间依赖性。
关键词： AMD3100；甲胎蛋白；肝癌细胞；癌细胞增殖；CXCR4
【中图分类号】R749.053【文献标识码】B【文章编号】1672-8602（2014）07-0152-02
基金项目： 国家自然科学基金项目（30960153）；2013年海南省教育厅重点项目（Hjkj2013-27）
AMD3100是趋化因子受体CXCR4（ CXC chemokine receptor 4，CXCR4）特异性阻断剂，是一种小分子非肽类抑制剂，是桥联 1，4，8，11-四氮杂环十四烷，它在治疗肿瘤、HIV 感染、炎性疾病和干细胞动员中具有很强的应用潜力[1]。AFP是早期诊断肝细胞癌的特异性标志物，具有促进人肝癌细胞的增殖作用[2，3]。本研究应用AMD3100作用于人肝癌HepG2细胞，观察其在不同时间点对HepG2细胞生长的影响及其与AFP表达的关系。
1 材料与方法
1.1实验材料
人肝癌细胞株HepG2（北京大学医学部提供），兔抗人AFP抗体， CXCR4抗体，β-actin 抗体，辣根标记的羊抗兔IgG均购买于Stanta Cruz（America）公司；AMD3100（Sigma，America），DMEM高糖培养基，MTT（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide），96、6孔板均购自美国Gibco公司。优质胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；蛋白质印记marker（北京全式金生物技术有限公司）；硝酸纤维素膜（BioRad，America）。
1.2方法
1.2.1 MTT法检测不同时间AMD3100对细胞增殖的影响
用含有10%胎牛血清的DMEM培养HepG2细胞，分别以合适的密度接种于96孔板（12h组1.0×105个/ml；24h组及36h组5.0×104个/ml；48h组3.0×104个/ml；72h组2.0×104个/ml），100μl/孔，每组设6个平行孔。培养24h后，更换新的培养液，100μl/孔。对照组不处理，加药组加入AMD3100至终浓度为1.5μg/ml，对照组加入与加药组同体积的H2O（因AMD3100溶于水）。分别在细胞培养12h，24h，36h，48h，72h后，每孔加入20μlMTT，37℃孵育4h。去掉所有的液体，加入100μl/孔二甲基亚砜，微量振荡仪振荡10min，自动酶标仪（Bio-TEK Instruments.Inc）在490nm波长测吸光值。细胞增殖抑制率=（对照组OD-实验组OD）/ 对照组OD。
1.2.2 Western blot检测不同时间点AMD3100对AFP表达的影响。
将HepG2细胞按合适的密度（12h组1.0×105个/ml；24h组及36h组5.0×104个/ml；48h组3.0×104个/ml），接种于6孔板中，每组设3个重复平行孔，加入到含10%胎牛血清的DMEM培养，24h后，对照组不处理，加药组分别加入AMD3100至终浓度为1.5μg /ml培养细胞。分别在细胞培养0h，12h，24h，36h，48h后，收取细胞，提取蛋白，定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳，再把蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素（NC）膜，进行抗原-抗体结合反应，用化学发光仪（LAS3000）（FUJI，Japan）检测细胞AFP表达的变化，具体操作按文献[6]方法进行。
1.2.6 统计学处理 应用统计学软件SPSS11.5对数据进行t-test，P﹤0.05具有统计学意义，P﹤0.01具有显著统计学意义。
2 结果
2.1 AMD3100对HepG2细胞增殖的抑制作用
MTT结果表明，在12h，24h，AMD3100对HepG2细胞的增殖没有显著性影响，在36h，48h和72h，AMD3100对HepG2细胞增殖抑制率分别为 35.2%，44.3%和56.3%，和对组比较有显著性差异，呈时间依赖性，P<0.01（见图1）。
图1.不同的时间点AMD3100对HepG2细胞增殖的抑制作用
AMD3100（1.5 g/ml）处理HepG2细胞，分别在12h，24h，36h，48h，72h，用MTT法检测并计算其抑制率。和对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
2.2 不同用药时间点AMD3100对HepG2细胞AFP表达的影响
Western blot结果表明，用浓度为1.5 g/ml的AMD3100处理HepG2细胞，在12h，24h，HepG2细胞表达AFP没有显著性变化，在36h、48h，HepG2细胞表达AFP显著减少，呈时间依赖性。