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[摘要] 目的 探讨甲状旁腺素对人甲状腺髓样癌细胞体外增殖抑制及凋亡作用。 方法 体外培养甲状腺髓样癌细胞株，经甲状旁腺素和甲状旁腺素受体单抗干预处理后，倒置相差显微镜下观察细胞生长状况，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 倒置相差显微镜下细胞变化明显，各浓度的甲状旁腺素和甲状旁腺素受体单抗均分别能有效地抑制甲状腺髓样癌细胞增殖、诱导细胞凋亡，凋亡作用呈时间和浓度依赖。当甲状旁腺素浓度为2.0μmol/L、甲状旁腺素受体单抗浓度为1.0μmol/L时，对细胞凋亡作用显著（P<0.05），凋亡率分别为13.24%及20.78%。 结论 甲状旁腺素对人甲状腺髓样癌细胞增殖有抑制作用并能诱导其凋亡。
[关键词] 甲状旁腺素；甲状腺髓样癌；凋亡
[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）05-29-04
甲状旁腺素（parathyroid hormone，PTH）由甲状旁腺分泌，它与降钙素（calcitonin，CT）共同调节人体钙磷代谢[1]。有报道甲状旁腺素相关肽对肿瘤细胞有增殖作用[2-4]。本研究用人甲状腺髓样癌细胞株（TT细胞株）作为研究对象，分别给于PTH和甲状旁腺素受体单抗（anti-parathyroid hormone receptor1 antibody，anti-PTHR1）干预处理，观察TT细胞生长状况，检测细胞凋亡，研究PTH和anti-PTHR1对甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma ，MTC）细胞凋亡的影响作用，可望为MTC的治疗提供新的理论基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及设备
人甲状腺髓样癌TT细胞株（购于中国科学院上海细胞库），胎牛血清（购自美国Sigma公司），F12k培养基（购自美国Gibco公司）。胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、四甲基耦氮唑盐（MTT）、甲基亚砜（DMSO）及PTH均购自美国Sigma公司。anti-PTHR1（购自美国abcanm公司），流式细胞仪检测盒（购自美国BD公司）。倒置相差显微镜（日本Olympas产品），流式细胞仪（美国BD公司产品）。其他常规设备由国内生产。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和处理 人甲状腺髓样癌TT细胞株培养于37℃的F12K培养基中（含15%胎牛血清和500U/mL青霉素、100μg/mL链霉素），常规消化传代。对数生长期的TT细胞，以1×106/mL细胞浓度接种于一批25mL培養瓶中（2mL/瓶），24h后分组加入PTH及anti-PTHR1。PTH浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L；anti-PTHR1浓度分别为0、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/L，24h后观察细胞变化结果。
1.2.2 流式细胞仪检测TT细胞凋亡 对数生长期的TT细胞消化传代后设：（1）对照组（不加PTH及anti-PTHR1）；（2）PTH干预组；（3）anti-PTHR1干预组。PTH浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L；anti-PTHR1浓度分别为0、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/L。48h后用PBS离心洗涤，弃去上清液。由专人按照说明书操作，最后将样品置于冰上轻轻混匀，流式细胞仪检测。
1.3 统计学方法
应用SPSS17.0软件进行统计学处理，组间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析。
2 结果
2.1 PTH及anti-PTHR1对TT细胞生长影响
光学显微镜下见对照组细胞呈单层，生长状态良好，细胞透明且界限清楚。用PTH和anti-PTHR1处理24h后，随着浓度增加、作用时间延长，细胞数量减少，细胞形态逐渐皱缩变圆与周围的细胞分离，细胞体积缩小，培养液中见到许多碎片及颗粒。部分细胞核开始浓缩，核膜逐渐崩解，染色质分割成块状等呈现出细胞凋亡的变化。
2.2 PTH及anti-PTHR1对TT细胞的凋亡作用
流式细胞仪检测结果显示，照组细胞无明显变化（图1）。经PTH及anti-PTHR1处理TT细胞后，各浓度的PTH和anti-PTHR1均可引起TT细胞的凋亡。凋亡作用随药物浓度增加而加强、在相同浓度下凋亡作用随时间延长而上升，呈时间和浓度依赖。凋亡率与浓度和时间均呈正相关（P<0.05）。当PTH浓度为2.0μmol/L时，对TT细胞的凋亡作用显著，凋亡率13.24%（P<0.05）。见图2；anti-PTHR1浓度为1.0μmol/L时，对TT细胞的凋亡作用显著，凋亡率20.78%（P<0.05）。见图3。
3 讨论
甲状腺癌目前的治疗方法主要是外科手术、甲状腺素内分泌治疗及131碘核素内照射治疗。甲状腺髓样癌（MTC）起源于滤泡旁细胞（C细胞），具有神经内分泌系统恶性肿瘤的特性，降钙素是其特殊的标志物[5-6]，手术切除仍是其首选的根治方式。
MTC与分化型甲状腺癌不同，因起源于C细胞，不受促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）的影响，不表达钠/碘转运蛋白（sodium/iodide symporter，NIS）、也不摄碘，TSH抑制治疗和I131核素内照射治疗无效[7]。MTC具有早期转移的特性，约10%～15%的患者在初诊时已有远处转移，很难通过手术而达到根治，手术治疗后10年生存率远低于分化型甲状腺癌[8]。有关人甲状腺髓样癌细胞体外生长增值的研究报道较多[9-11]。各种生物免疫治疗、分子靶向药物、肿瘤疫苗、单克隆抗体、免疫基因等已经在临床前试验中取得了一定的疗效，部分药物已经开始临床使用，但疗效不理想[12-15]。因此，研究MTC的发生发展机制，阐明其发病机理并探索MTC新的治疗途径，寻找新的有效分子治疗靶点，针对肿瘤细胞生长的某些主要环节，开发新的治疗药物，是目前甲状腺癌研究领域的难点和热点问题之一。 甲状旁腺素作为一种调节人体钙磷代谢的内分泌激素，是否参与MTC的发生发展及对MTC细胞生长和增殖存在影响，目前国内外尚未见报道。有研究表明地塞米松能抑制甲状腺髓样癌TT细胞的增值，主要通过抑制细胞G1期而诱导凋亡[16]，另有报道蛋白激酶C在体外通过增加细胞凋亡而抑制甲状腺髓样癌细胞的扩散[17]。本研究对甲状腺髓样癌TT细胞给予PTH和anti-PTHR1兩种药物干预，光镜观察结果显示对照组TT细胞呈单层，梭形或多边形贴壁生长，从细胞形态观察，其生长状态良好。TT细胞经PTH和anti-PTHR1干预后，细胞变圆且比较凌乱，细胞质固缩，细胞核质比减小，显示TT细胞生长及增殖活性均受到显著抑制作用，部分细胞核开始浓缩、边缘化，核膜逐渐崩解，染色质分割成块状等变化，该变化反映了细胞的凋亡。其作用强度随药物浓度增加和作用时间延长而增加。流式细胞仪检测结果显示，不同浓度的PTH和anti-PTHR1均可引起TT细胞凋亡，差异有显著性（P<0.05），凋亡率与浓度和时间均呈正相关（P<0.05）。当PTH浓度为2.0μmol/L、anti-PTHR1浓度为1.0μmol/L时，对TT细胞的凋亡作用最为显著（P<0.05）。提示PTH和anti-PTHR1不但具有抑制TT细胞增值的作用，同时还可诱导其凋亡。可见，PTH对人甲状腺髓样癌TT细胞形态和结构的作用与对细胞诱导凋亡作用是一致的，说明PTH和anti-PTHR1具有抑制人甲状腺髓样癌TT细胞生长和诱导TT细胞凋亡双重的生物学效应。这将为今后进一步研究PTH对MTC的作用机制提供了理论依据和重要的参考。
综上所述，本研究初步证实了PTH和anti-PTHR1对人甲状腺髓样癌细胞的抑制作用，能有效诱导人甲状腺髓样癌TT细胞的凋亡。深入探索其诱导凋亡机制，对于进一步研究PTH对人甲状腺髓样癌TT细胞的作用机制，具有非常重要的指导意义和实际应用价值。随着对PTH研究及认识的不断深入，PTH和anti-PTHR1可能成为一种新的抗肿瘤治疗靶点，为甲状腺髓样癌早期诊断及治疗提供新的途径。
[参考文献]
[1] Di Cosimo，Metere A，Chiesa C，et al.Mediastinal parathyroid adenoma：a case report[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2012，16（5）：845-847.
[2] 梁华晟，薛耀明.钟宇华甲状旁腺素相关肽对INS-1细胞株增殖的影响[J].实用医学杂志，2010，26（8）：1286-1288
[3] Alokail M S，Peddie M J.Quantitative comparison of PTH1R in breast cancer MCF7 and osteosarcoma SaOS-2 cell lines[J].Cell Biochem Funct，2008，26（4）：4522-4533.
[4] Dittmer A，Vetter M，Schunke D，et al.Parathyroid hormone-related protein regulates tumor-relevant genes in breast cancer cells[J].J Biol Chem，2006，281（21）：14563-14572.
[5] Yu GP，Li JC，Branovan D，et al.Thyroid cancer incidence and survival in the national cancer institute surveillance，epidemiology and end results race/ethnicity groups[J].Thyroid，2010，20（5）：465-473.
[6] Kazaure HS，Roman SA，Sosa JA.Medullary thyroid microcarcinoma： a population-level analysis of 310 patients[J].Cancer，2012 ，118（3）：620-627.
[7] Xu L，Zhao YP，Wang WB，et al.Clinical characteristics of hereditary and sporadic medullary thyroid carcinoma Clinical[J].Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2012，34（4）：401-404.
[8] Dionigi G，Tanda ML，Piantanida E.Medullary thyroid carcinoma：surgical treatment advances [J].Current opinion in otolaryngology & head and neck surgery，2008，16（2）：158-162.
[9] Tomoda C，Moatamed F，Naeim F，et al.Indomethacin inhibits cell growth of medullary thyroid carcinoma by reducing cell cycle progression into S phase[J].Exp Biol Med （Maywood），2008，233（11）：1433-1440.
[10] Klubo-Gwiezdzinska J，Jensen K，Costello J，et al. Metformin inhibits growth and decreases resistance to anoikis in medullary thyroid cancer cells[J].Endocr Relat Cancer，2012，19（5）：447-456. [11] Li Z， Sturm S， Svejda B， et al.Anticancer activity of novel extracts from Cautleya gracilis （Smith） Dandy：apoptosis inhuman medullary thyroid carcinoma cells[J].Anticancer Res，2008，28（5A）：2705-2713.
[12] Robinson BG，Paz-Ares L，Krebs A，et al.Vandetanib （100 mg） in patients with locally advanced or metastatic hereditary medullary thyroid cancer[J].Clin Endocrinol Metab，2010，95（6）：2664-2671.
[13] Kurzrock R，Sherman SI，Ball DW，et al.Activity of XL184 （Cabozantinib）， an oral tyrosine kinase inhibitor，in patients with medullary thyroid cancer[J].Clin Oncol，2011，29（19）：2660-2666.
[14] Sherman SI.Targeted therapy of thyroid cancer[J].Biochem Pharmacol，2010，80（5）：592-601.
[15] Baldini E，Arlot-Bonnemains Y，Sorrenti S，et al.Aurora kinases are expressed in medullary thyroid carcinoma（MTC）and their inhibitionsuppresses in vitro growth and tumorigenicity of the MTC derived cell line TT[J].BMC Cancer，2011，11（2）：411.
[16] Chung YJ，Lee JI，Chong S，et al.Anti-proliferative effect and action mechanism of dexamethasone in human medullary thyroid cancer cell line[J].Endocr Res，2011，36（4）：149-157.
[17] Molè D，Gentilin E，Gagliano T，et al.Protein kinase C：a putative new target for the control of human medullary thyroidcarcinoma cell proliferation in vitro[J].Endocrinology，2012，153（8）：2088-2098.
（收稿日期：2013-12-14）
[关键词] 甲状旁腺素；甲状腺髓样癌；凋亡
[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）05-29-04
甲状旁腺素（parathyroid hormone，PTH）由甲状旁腺分泌，它与降钙素（calcitonin，CT）共同调节人体钙磷代谢[1]。有报道甲状旁腺素相关肽对肿瘤细胞有增殖作用[2-4]。本研究用人甲状腺髓样癌细胞株（TT细胞株）作为研究对象，分别给于PTH和甲状旁腺素受体单抗（anti-parathyroid hormone receptor1 antibody，anti-PTHR1）干预处理，观察TT细胞生长状况，检测细胞凋亡，研究PTH和anti-PTHR1对甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma ，MTC）细胞凋亡的影响作用，可望为MTC的治疗提供新的理论基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及设备
人甲状腺髓样癌TT细胞株（购于中国科学院上海细胞库），胎牛血清（购自美国Sigma公司），F12k培养基（购自美国Gibco公司）。胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、四甲基耦氮唑盐（MTT）、甲基亚砜（DMSO）及PTH均购自美国Sigma公司。anti-PTHR1（购自美国abcanm公司），流式细胞仪检测盒（购自美国BD公司）。倒置相差显微镜（日本Olympas产品），流式细胞仪（美国BD公司产品）。其他常规设备由国内生产。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和处理 人甲状腺髓样癌TT细胞株培养于37℃的F12K培养基中（含15%胎牛血清和500U/mL青霉素、100μg/mL链霉素），常规消化传代。对数生长期的TT细胞，以1×106/mL细胞浓度接种于一批25mL培養瓶中（2mL/瓶），24h后分组加入PTH及anti-PTHR1。PTH浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L；anti-PTHR1浓度分别为0、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/L，24h后观察细胞变化结果。
1.2.2 流式细胞仪检测TT细胞凋亡 对数生长期的TT细胞消化传代后设：（1）对照组（不加PTH及anti-PTHR1）；（2）PTH干预组；（3）anti-PTHR1干预组。PTH浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L；anti-PTHR1浓度分别为0、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/L。48h后用PBS离心洗涤，弃去上清液。由专人按照说明书操作，最后将样品置于冰上轻轻混匀，流式细胞仪检测。
1.3 统计学方法
应用SPSS17.0软件进行统计学处理，组间比较采用t检验，多组间比较用单因素方差分析。
2 结果
2.1 PTH及anti-PTHR1对TT细胞生长影响
光学显微镜下见对照组细胞呈单层，生长状态良好，细胞透明且界限清楚。用PTH和anti-PTHR1处理24h后，随着浓度增加、作用时间延长，细胞数量减少，细胞形态逐渐皱缩变圆与周围的细胞分离，细胞体积缩小，培养液中见到许多碎片及颗粒。部分细胞核开始浓缩，核膜逐渐崩解，染色质分割成块状等呈现出细胞凋亡的变化。
2.2 PTH及anti-PTHR1对TT细胞的凋亡作用
流式细胞仪检测结果显示，照组细胞无明显变化（图1）。经PTH及anti-PTHR1处理TT细胞后，各浓度的PTH和anti-PTHR1均可引起TT细胞的凋亡。凋亡作用随药物浓度增加而加强、在相同浓度下凋亡作用随时间延长而上升，呈时间和浓度依赖。凋亡率与浓度和时间均呈正相关（P<0.05）。当PTH浓度为2.0μmol/L时，对TT细胞的凋亡作用显著，凋亡率13.24%（P<0.05）。见图2；anti-PTHR1浓度为1.0μmol/L时，对TT细胞的凋亡作用显著，凋亡率20.78%（P<0.05）。见图3。
3 讨论
甲状腺癌目前的治疗方法主要是外科手术、甲状腺素内分泌治疗及131碘核素内照射治疗。甲状腺髓样癌（MTC）起源于滤泡旁细胞（C细胞），具有神经内分泌系统恶性肿瘤的特性，降钙素是其特殊的标志物[5-6]，手术切除仍是其首选的根治方式。
MTC与分化型甲状腺癌不同，因起源于C细胞，不受促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）的影响，不表达钠/碘转运蛋白（sodium/iodide symporter，NIS）、也不摄碘，TSH抑制治疗和I131核素内照射治疗无效[7]。MTC具有早期转移的特性，约10%～15%的患者在初诊时已有远处转移，很难通过手术而达到根治，手术治疗后10年生存率远低于分化型甲状腺癌[8]。有关人甲状腺髓样癌细胞体外生长增值的研究报道较多[9-11]。各种生物免疫治疗、分子靶向药物、肿瘤疫苗、单克隆抗体、免疫基因等已经在临床前试验中取得了一定的疗效，部分药物已经开始临床使用，但疗效不理想[12-15]。因此，研究MTC的发生发展机制，阐明其发病机理并探索MTC新的治疗途径，寻找新的有效分子治疗靶点，针对肿瘤细胞生长的某些主要环节，开发新的治疗药物，是目前甲状腺癌研究领域的难点和热点问题之一。 甲状旁腺素作为一种调节人体钙磷代谢的内分泌激素，是否参与MTC的发生发展及对MTC细胞生长和增殖存在影响，目前国内外尚未见报道。有研究表明地塞米松能抑制甲状腺髓样癌TT细胞的增值，主要通过抑制细胞G1期而诱导凋亡[16]，另有报道蛋白激酶C在体外通过增加细胞凋亡而抑制甲状腺髓样癌细胞的扩散[17]。本研究对甲状腺髓样癌TT细胞给予PTH和anti-PTHR1兩种药物干预，光镜观察结果显示对照组TT细胞呈单层，梭形或多边形贴壁生长，从细胞形态观察，其生长状态良好。TT细胞经PTH和anti-PTHR1干预后，细胞变圆且比较凌乱，细胞质固缩，细胞核质比减小，显示TT细胞生长及增殖活性均受到显著抑制作用，部分细胞核开始浓缩、边缘化，核膜逐渐崩解，染色质分割成块状等变化，该变化反映了细胞的凋亡。其作用强度随药物浓度增加和作用时间延长而增加。流式细胞仪检测结果显示，不同浓度的PTH和anti-PTHR1均可引起TT细胞凋亡，差异有显著性（P<0.05），凋亡率与浓度和时间均呈正相关（P<0.05）。当PTH浓度为2.0μmol/L、anti-PTHR1浓度为1.0μmol/L时，对TT细胞的凋亡作用最为显著（P<0.05）。提示PTH和anti-PTHR1不但具有抑制TT细胞增值的作用，同时还可诱导其凋亡。可见，PTH对人甲状腺髓样癌TT细胞形态和结构的作用与对细胞诱导凋亡作用是一致的，说明PTH和anti-PTHR1具有抑制人甲状腺髓样癌TT细胞生长和诱导TT细胞凋亡双重的生物学效应。这将为今后进一步研究PTH对MTC的作用机制提供了理论依据和重要的参考。
综上所述，本研究初步证实了PTH和anti-PTHR1对人甲状腺髓样癌细胞的抑制作用，能有效诱导人甲状腺髓样癌TT细胞的凋亡。深入探索其诱导凋亡机制，对于进一步研究PTH对人甲状腺髓样癌TT细胞的作用机制，具有非常重要的指导意义和实际应用价值。随着对PTH研究及认识的不断深入，PTH和anti-PTHR1可能成为一种新的抗肿瘤治疗靶点，为甲状腺髓样癌早期诊断及治疗提供新的途径。
[参考文献]
[1] Di Cosimo，Metere A，Chiesa C，et al.Mediastinal parathyroid adenoma：a case report[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2012，16（5）：845-847.
[2] 梁华晟，薛耀明.钟宇华甲状旁腺素相关肽对INS-1细胞株增殖的影响[J].实用医学杂志，2010，26（8）：1286-1288
[3] Alokail M S，Peddie M J.Quantitative comparison of PTH1R in breast cancer MCF7 and osteosarcoma SaOS-2 cell lines[J].Cell Biochem Funct，2008，26（4）：4522-4533.
[4] Dittmer A，Vetter M，Schunke D，et al.Parathyroid hormone-related protein regulates tumor-relevant genes in breast cancer cells[J].J Biol Chem，2006，281（21）：14563-14572.
[5] Yu GP，Li JC，Branovan D，et al.Thyroid cancer incidence and survival in the national cancer institute surveillance，epidemiology and end results race/ethnicity groups[J].Thyroid，2010，20（5）：465-473.
[6] Kazaure HS，Roman SA，Sosa JA.Medullary thyroid microcarcinoma： a population-level analysis of 310 patients[J].Cancer，2012 ，118（3）：620-627.
[7] Xu L，Zhao YP，Wang WB，et al.Clinical characteristics of hereditary and sporadic medullary thyroid carcinoma Clinical[J].Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2012，34（4）：401-404.
[8] Dionigi G，Tanda ML，Piantanida E.Medullary thyroid carcinoma：surgical treatment advances [J].Current opinion in otolaryngology & head and neck surgery，2008，16（2）：158-162.
[9] Tomoda C，Moatamed F，Naeim F，et al.Indomethacin inhibits cell growth of medullary thyroid carcinoma by reducing cell cycle progression into S phase[J].Exp Biol Med （Maywood），2008，233（11）：1433-1440.
[10] Klubo-Gwiezdzinska J，Jensen K，Costello J，et al. Metformin inhibits growth and decreases resistance to anoikis in medullary thyroid cancer cells[J].Endocr Relat Cancer，2012，19（5）：447-456. [11] Li Z， Sturm S， Svejda B， et al.Anticancer activity of novel extracts from Cautleya gracilis （Smith） Dandy：apoptosis inhuman medullary thyroid carcinoma cells[J].Anticancer Res，2008，28（5A）：2705-2713.
[12] Robinson BG，Paz-Ares L，Krebs A，et al.Vandetanib （100 mg） in patients with locally advanced or metastatic hereditary medullary thyroid cancer[J].Clin Endocrinol Metab，2010，95（6）：2664-2671.
[13] Kurzrock R，Sherman SI，Ball DW，et al.Activity of XL184 （Cabozantinib）， an oral tyrosine kinase inhibitor，in patients with medullary thyroid cancer[J].Clin Oncol，2011，29（19）：2660-2666.
[14] Sherman SI.Targeted therapy of thyroid cancer[J].Biochem Pharmacol，2010，80（5）：592-601.
[15] Baldini E，Arlot-Bonnemains Y，Sorrenti S，et al.Aurora kinases are expressed in medullary thyroid carcinoma（MTC）and their inhibitionsuppresses in vitro growth and tumorigenicity of the MTC derived cell line TT[J].BMC Cancer，2011，11（2）：411.
[16] Chung YJ，Lee JI，Chong S，et al.Anti-proliferative effect and action mechanism of dexamethasone in human medullary thyroid cancer cell line[J].Endocr Res，2011，36（4）：149-157.
[17] Molè D，Gentilin E，Gagliano T，et al.Protein kinase C：a putative new target for the control of human medullary thyroidcarcinoma cell proliferation in vitro[J].Endocrinology，2012，153（8）：2088-2098.
（收稿日期：2013-12-14）