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摘 要：建立测定鱼肉中四聚乙醛残留量的液相色谱串联质谱分析方法。样品经乙腈提取，提取液经盐析后采用N-丙基乙二胺和C18填料净化，净化液经0.1%甲酸溶液稀释后进样分析。分析时采用Acquity BEH C18，以0.1%甲酸溶液和乙腈作为流动相作梯度洗脱，电喷雾正电子（ESI+）模式电离，多反应监测（MRM）模式检测，内标法校准进行定量。四聚乙醛在0.05～5.0 μg/L质量浓度范围内呈良好的线性，线性相关系数大于0.999，鱼肉样品中最低定量限为1.0 μg/kg。鱼肉样品中添加1.0～2.0 μg/kg的回收率在98.5%～100.8%之间，相对标准偏差均小于10%。
关键词：四聚乙醛；残留；液相色谱串联质谱法；鱼肉
Determination of Residual Metaldehyde in Fish Meat by Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry
Lü Yan1， LIU Yongjun2， JIANG Xiaoxiao1， CHEN Guo1， WU Yinliang1，*
（1. Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China；
2. The Center for Animal Disease Control and Prevention， Beijing 100125， China）
Abstract： A method was developed for determining residual metaldehyde in fish meat by liquid chromatography with tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）. Fish meat samples were extracted with acetonitrile and sequentially purified by salting-out method followed by solid phase extraction with PSA and C18 sorbent. After dilution with 0.1% formic acid solution， the samples were analyzed by LC-MS/MS on a Waters Acquity BEH C18 column with acetonitrile/0.1 % formic acid in water as mobile phase with gradient elution. The mass spectrometer was operated using multiple reaction monitoring （MRM） in the positive ion mode. The analyte was quantified by the internal standard calibration curve method. Good linearity was obtained for metaldehyde in the concentration range of 0.05–5.0 μg/L with linear relative coefficient more than 0.999. The recoveries in fish meat were 98.5%–100.8% at fortified levels of 1.0–2.0 μg/kg with a limit of quantitation of 1.0 μg/kg for metaldehyde. The relative standard deviations of intra-assay and inter-assay were below 10%. The method was demonstrated to be suitable for the determination of metaldehyde in fish meat.
Key words： metaldehyde； residue； liquid chromatography with tandem mass spectrometry； fish meat
中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2015）04-0035-04
doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201504008
四聚乙醛是乙醛聚合而成的四聚物，是一种选择性很强的软体动物杀灭剂，广泛应用于防治作物上的田螺、蜗牛和蛞蝓[1-2]。虽然四聚乙醛毒性较低，但由于四聚乙醛导致人畜中毒的事例也时有发生[3-4]，作为一种环境污染物，四聚乙醛残留在水产品中对人类健康威胁同样存在，但目前为此我国尚未制定四聚乙醛在水产品中的残留限量，欧盟仅规定了两栖动物（如鳄鱼肉）的残留限量为0.05 mg/kg，但从完善标准体系和保障公众身体健康角度出发，建立水产品中简单准确的四聚乙醛残留量分析方法标准已是迫在眉睫。
目前对于四聚乙醛残留量分析方法主要有：高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）法[5]、气相色谱法（gas chromatography，GC）
法[6]、气相色谱质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[3，7]和液相色谱串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）法[8-10]。其中GC法和HPLC法分析时，前处理步骤包括复杂的衍生化反应步骤，致使方法较复杂。虽然GC-MS法可以不用衍生直接进样，但从已有的GC-MS法可知，四聚乙醛低浓度时易受干扰[7]。目前
LC-MS/MS在药物残留分析中已得到广泛应用[11-20]，虽然在四聚乙醛残留分析中有所应用，但在动物性食品包括水产品中四聚乙醛残留分析的LC-MS/MS方法尚未见有相关报道。本研究开展了鱼肉中四聚乙醛提取方法、净化方法和仪器方法的研究，所建立的LC-MS/MS方法具有灵敏度高、重复性好的特点，能够满足现行药物残留分析的要求。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鱼肉购于宁波市江东区欧尚超市。
四聚乙醛（95%）、四聚乙醛-D16（95%）
德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈（色谱纯） 美国默克
公司；甲酸（色谱纯） 美国天地有限公司；N-丙基乙二胺（PSA） 美国Agilent公司；其他试剂均为分析纯试剂。
1.2 仪器与设备
液相色谱串联质谱联用仪 美国Waters公司；3K15离心机 美国Sigma公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
1.3.1.1 标准储备液
准确分别称取含10.0 mg四聚乙醛和四聚乙醛-D16的标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得四聚乙醛和四聚乙醛-D16标准储备液，质量浓度均为100 μg/mL。
1.3.1.2 标准工作中间液
分别精密量取0.5mL 100 μg/mL的四聚乙醛和四聚乙醛-D16标准储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，分别配制成质量浓度为5.0 μg/mL的标准工作液。
1.3.1.3 标准工作液
精密量取四聚乙醛和四聚乙醛-D16标准工作中间液适量，逐级用50%乙腈溶液溶解并稀释成均含四聚乙醛-D16质量浓度为1.25 ng/mL的0.05、0.10、0.25、0.50、1.0、2.5、5.0 ng/mL系列四聚乙醛标准工作溶液，现配现用。
1.3.2 样品前处理
准确称取5.0 g鱼肉样品于带盖的50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入经乙腈稀释的四聚乙醛-D16标准工作液（0.25 μg/mL）100 μL，再依次加入2 mL水和10 mL乙腈，以10 000 r/min速度匀质1 min后加入2 g氯化钠，加盖涡漩混合1 min后以5000 r/min的速度离心2 min，然后将2 mL上清液转入装有0.3 g无水硫酸镁、0.1 g C18、0.1 g PSA的5 mL离心管中，漩涡混匀1 min，5 000 r/min离心2 min，吸取0.5 mL上清液与0.5 mL 0.1%甲酸溶液混匀后过0.22 ?m滤膜，供LC-MS/MS测定。
1.3.3 液相色谱条件
色谱柱Acquity UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×
2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）（梯度洗脱）；梯度洗脱程序：0～0.5 min，10%～30%乙腈；0.5～1.5 min，30%～95%乙腈，保持2.0 min；3.5～3.6 min，95%～10%乙腈；再保持1.4 min。流速0.3 mL/min，柱温30 ℃；进样量10 μL。
1.3.4 质谱条件
质谱条件优化时采用1 000 μg/L的四聚乙醛和四聚乙醛-D16标准工作溶液，利用IntelliStart软件进行优化。
电离模式：ESI源正离子模式；多级反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）；毛细管电压2.0 kV；萃取锥孔电压30 V；RF透镜电压0.5 V；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度500 ℃；锥孔气流速50 L/h；脱溶剂气流速1000 L/h；倍增器电压650 V；二级碰撞气：氩气；各物质的定性定量离子对等参数详见表1。
2 结果与分析
2.1 仪器条件的选择
2010年前对于四聚乙醛残留LC-MS/MS分析方法仅见英国环保署建立的水样中四聚乙醛LC-MS/MS分析方法，该方法采用[M+Na]+作为母离子，仅有一对离子对（m/z
199.1/67.0）用于监测。然而经实验前期研究发现，四聚乙醛电离时准分子离子峰至少有[M+H]+、[M+NH4]+和[M+Na]+ 3 种形式，其中[M+NH4]+不仅响应好，且从子离子中可选择出2 个离子对进行LC-MS/MS分析，因此本研究采用[M+NH4]+作为母离子，经优化后m/z 194.2/62.2，m/z 194.2/106.2两离子对用于鱼肉中四聚乙醛残留量分析。
四聚乙醛极性较弱，当采用乙腈为有机相时，同样色谱条件下出峰时间明显快于甲醇为有机相时；当分别采用20 mmol/L乙酸铵溶液/乙腈、0.1%甲酸溶液/乙腈、0.1%甲酸溶液/甲醇进行梯度洗脱分析四聚乙醛时，20 mmol/L乙酸铵溶液/乙腈作为流动相分析时四聚乙醛的灵敏度相对较差，而后两种溶液作为流动相分析时四聚乙醛的灵敏度相对较好，且差异不明显。因此，本研究中采用0.1%甲酸溶液/乙腈作为流动相对四聚乙醛进行分析。
2.2 前处理条件的选择
根据NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》的方法，采用乙腈作为提取剂对四聚乙醛提取效果进行了研究，结果显示不同用量（均大于10 mL）的乙腈回收率均在90%以上，本实验采用最小的乙腈量进行提取，即10 mL。 对于四聚乙醛的净化，液体样品常采用固相微萃取进行净化，固体样品常采用提取后固相萃取净化。由于四聚乙醛发表的残留分析方法较少，仅见中性氧化铝小柱作为固相萃取净化柱使用。由于中性氧化铝小柱净化时所需时间相对较长，本研究决定尝试采用QuEChERS方法进行净化。为考察QuEChERS方法净化的效果，本方法标准实验过程中考察了2 mL上清液在使用0.3 g MgSO4和不同用量PSA和C18填料（PSA和C18同时使用，且每种处理两者使用量一致）对于鲫鱼肉样品基质效应的改善情况。结果发现，随着PSA和C18填料使用量的增加，四聚乙醛的基质效应明显改善，基质标准曲线与标准工作液的斜率比值分别为0.412（0 mg）、0.658（25 mg）、0.744（50 mg）、0.824（100 mg）、0.902（150 mg）和0.924（200 mg）。考虑到使用成本与基质效应的改善程度（比值0.8～1.2为可接爱范围），本研究最终选择100 mg的PSA和C18填料进行实验。
2.3 方法参数
2.3.1 标准曲线与线性范围
根据1.3.1.3节配制的标准工作溶液，对四聚乙醛在0.05～5.0 μg/L质量浓度范围内，以四聚乙醛质量浓度为横坐标（x），待测物定量离子峰面积与内标离子峰面积的比值为纵坐标（y），所得标准曲线方程为y=0.729 5x―0.025，相关系数（R2）为0.9995。标准溶液图谱见图1。
1. m/z 210.3/66.1（四聚乙醛-D16）；2. m/z 194.2/106.2（四聚乙醛）；3. m/z 194.2/62.2（四聚乙醛）。
图 1 四聚乙醛标准溶液（0.05 μg/L）（a）、鲫鱼肉空白样品（b）和添加样品（1.0 μg/kg）（c）色谱图
Fig.1 Chromatograms of metaldehyde in standard solution （a， 0.05 μg/L）， fish blank sample （b） and fortified fish sample （c， 1.0 μg/kg）
2.3.2 灵敏度
根据测定标准曲线所得的结果，配制相近质量浓度的阳性添加样品，测定其实际信噪比。以RSN=3为检测限，以RSN=10为定量限。结果表明，鸡肉样品中金刚烷胺的检出限为0.30 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。
2.3.3 准确度和精密度
取空白鲫鱼肉样品，加入标准工作溶液配制成1.0、1.5、2.0 μg/kg的加标样品，按照1.3.2节进行操作，每个添加水平重复3 次，对5 个加标样品进行定量分析。由
表2可知批内和批间的变异系数均小于10%，平均回收率均为98.5%～100.8%。
2.4 方法应用
利用该方法在2014年底对宁波市江东区大型超市所售的10 个鲫鱼样品进行了四聚乙醛残留量测定，所有样品均未检出四聚乙醛。
3 结 论
本研究建立了鱼肉中四聚乙醛测定的LC-MS/MS方法。鱼肉样品经乙腈提取，提取液经盐析后采用N-丙基乙二胺（PSA）和C18填料净化，净化液经0.1%甲酸溶液稀释后直接进行LC-MS/MS分析。该方法具有快速、灵敏、准确的特点，可适用于我国对水产品中四聚乙醛中残留分析监控要求。
参考文献：
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关键词：四聚乙醛；残留；液相色谱串联质谱法；鱼肉
Determination of Residual Metaldehyde in Fish Meat by Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry
Lü Yan1， LIU Yongjun2， JIANG Xiaoxiao1， CHEN Guo1， WU Yinliang1，*
（1. Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China；
2. The Center for Animal Disease Control and Prevention， Beijing 100125， China）
Abstract： A method was developed for determining residual metaldehyde in fish meat by liquid chromatography with tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）. Fish meat samples were extracted with acetonitrile and sequentially purified by salting-out method followed by solid phase extraction with PSA and C18 sorbent. After dilution with 0.1% formic acid solution， the samples were analyzed by LC-MS/MS on a Waters Acquity BEH C18 column with acetonitrile/0.1 % formic acid in water as mobile phase with gradient elution. The mass spectrometer was operated using multiple reaction monitoring （MRM） in the positive ion mode. The analyte was quantified by the internal standard calibration curve method. Good linearity was obtained for metaldehyde in the concentration range of 0.05–5.0 μg/L with linear relative coefficient more than 0.999. The recoveries in fish meat were 98.5%–100.8% at fortified levels of 1.0–2.0 μg/kg with a limit of quantitation of 1.0 μg/kg for metaldehyde. The relative standard deviations of intra-assay and inter-assay were below 10%. The method was demonstrated to be suitable for the determination of metaldehyde in fish meat.
Key words： metaldehyde； residue； liquid chromatography with tandem mass spectrometry； fish meat
中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2015）04-0035-04
doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201504008
四聚乙醛是乙醛聚合而成的四聚物，是一种选择性很强的软体动物杀灭剂，广泛应用于防治作物上的田螺、蜗牛和蛞蝓[1-2]。虽然四聚乙醛毒性较低，但由于四聚乙醛导致人畜中毒的事例也时有发生[3-4]，作为一种环境污染物，四聚乙醛残留在水产品中对人类健康威胁同样存在，但目前为此我国尚未制定四聚乙醛在水产品中的残留限量，欧盟仅规定了两栖动物（如鳄鱼肉）的残留限量为0.05 mg/kg，但从完善标准体系和保障公众身体健康角度出发，建立水产品中简单准确的四聚乙醛残留量分析方法标准已是迫在眉睫。
目前对于四聚乙醛残留量分析方法主要有：高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）法[5]、气相色谱法（gas chromatography，GC）
法[6]、气相色谱质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[3，7]和液相色谱串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）法[8-10]。其中GC法和HPLC法分析时，前处理步骤包括复杂的衍生化反应步骤，致使方法较复杂。虽然GC-MS法可以不用衍生直接进样，但从已有的GC-MS法可知，四聚乙醛低浓度时易受干扰[7]。目前
LC-MS/MS在药物残留分析中已得到广泛应用[11-20]，虽然在四聚乙醛残留分析中有所应用，但在动物性食品包括水产品中四聚乙醛残留分析的LC-MS/MS方法尚未见有相关报道。本研究开展了鱼肉中四聚乙醛提取方法、净化方法和仪器方法的研究，所建立的LC-MS/MS方法具有灵敏度高、重复性好的特点，能够满足现行药物残留分析的要求。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鱼肉购于宁波市江东区欧尚超市。
四聚乙醛（95%）、四聚乙醛-D16（95%）
德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈（色谱纯） 美国默克
公司；甲酸（色谱纯） 美国天地有限公司；N-丙基乙二胺（PSA） 美国Agilent公司；其他试剂均为分析纯试剂。
1.2 仪器与设备
液相色谱串联质谱联用仪 美国Waters公司；3K15离心机 美国Sigma公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
1.3.1.1 标准储备液
准确分别称取含10.0 mg四聚乙醛和四聚乙醛-D16的标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得四聚乙醛和四聚乙醛-D16标准储备液，质量浓度均为100 μg/mL。
1.3.1.2 标准工作中间液
分别精密量取0.5mL 100 μg/mL的四聚乙醛和四聚乙醛-D16标准储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，分别配制成质量浓度为5.0 μg/mL的标准工作液。
1.3.1.3 标准工作液
精密量取四聚乙醛和四聚乙醛-D16标准工作中间液适量，逐级用50%乙腈溶液溶解并稀释成均含四聚乙醛-D16质量浓度为1.25 ng/mL的0.05、0.10、0.25、0.50、1.0、2.5、5.0 ng/mL系列四聚乙醛标准工作溶液，现配现用。
1.3.2 样品前处理
准确称取5.0 g鱼肉样品于带盖的50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入经乙腈稀释的四聚乙醛-D16标准工作液（0.25 μg/mL）100 μL，再依次加入2 mL水和10 mL乙腈，以10 000 r/min速度匀质1 min后加入2 g氯化钠，加盖涡漩混合1 min后以5000 r/min的速度离心2 min，然后将2 mL上清液转入装有0.3 g无水硫酸镁、0.1 g C18、0.1 g PSA的5 mL离心管中，漩涡混匀1 min，5 000 r/min离心2 min，吸取0.5 mL上清液与0.5 mL 0.1%甲酸溶液混匀后过0.22 ?m滤膜，供LC-MS/MS测定。
1.3.3 液相色谱条件
色谱柱Acquity UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×
2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）（梯度洗脱）；梯度洗脱程序：0～0.5 min，10%～30%乙腈；0.5～1.5 min，30%～95%乙腈，保持2.0 min；3.5～3.6 min，95%～10%乙腈；再保持1.4 min。流速0.3 mL/min，柱温30 ℃；进样量10 μL。
1.3.4 质谱条件
质谱条件优化时采用1 000 μg/L的四聚乙醛和四聚乙醛-D16标准工作溶液，利用IntelliStart软件进行优化。
电离模式：ESI源正离子模式；多级反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）；毛细管电压2.0 kV；萃取锥孔电压30 V；RF透镜电压0.5 V；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度500 ℃；锥孔气流速50 L/h；脱溶剂气流速1000 L/h；倍增器电压650 V；二级碰撞气：氩气；各物质的定性定量离子对等参数详见表1。
2 结果与分析
2.1 仪器条件的选择
2010年前对于四聚乙醛残留LC-MS/MS分析方法仅见英国环保署建立的水样中四聚乙醛LC-MS/MS分析方法，该方法采用[M+Na]+作为母离子，仅有一对离子对（m/z
199.1/67.0）用于监测。然而经实验前期研究发现，四聚乙醛电离时准分子离子峰至少有[M+H]+、[M+NH4]+和[M+Na]+ 3 种形式，其中[M+NH4]+不仅响应好，且从子离子中可选择出2 个离子对进行LC-MS/MS分析，因此本研究采用[M+NH4]+作为母离子，经优化后m/z 194.2/62.2，m/z 194.2/106.2两离子对用于鱼肉中四聚乙醛残留量分析。
四聚乙醛极性较弱，当采用乙腈为有机相时，同样色谱条件下出峰时间明显快于甲醇为有机相时；当分别采用20 mmol/L乙酸铵溶液/乙腈、0.1%甲酸溶液/乙腈、0.1%甲酸溶液/甲醇进行梯度洗脱分析四聚乙醛时，20 mmol/L乙酸铵溶液/乙腈作为流动相分析时四聚乙醛的灵敏度相对较差，而后两种溶液作为流动相分析时四聚乙醛的灵敏度相对较好，且差异不明显。因此，本研究中采用0.1%甲酸溶液/乙腈作为流动相对四聚乙醛进行分析。
2.2 前处理条件的选择
根据NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》的方法，采用乙腈作为提取剂对四聚乙醛提取效果进行了研究，结果显示不同用量（均大于10 mL）的乙腈回收率均在90%以上，本实验采用最小的乙腈量进行提取，即10 mL。 对于四聚乙醛的净化，液体样品常采用固相微萃取进行净化，固体样品常采用提取后固相萃取净化。由于四聚乙醛发表的残留分析方法较少，仅见中性氧化铝小柱作为固相萃取净化柱使用。由于中性氧化铝小柱净化时所需时间相对较长，本研究决定尝试采用QuEChERS方法进行净化。为考察QuEChERS方法净化的效果，本方法标准实验过程中考察了2 mL上清液在使用0.3 g MgSO4和不同用量PSA和C18填料（PSA和C18同时使用，且每种处理两者使用量一致）对于鲫鱼肉样品基质效应的改善情况。结果发现，随着PSA和C18填料使用量的增加，四聚乙醛的基质效应明显改善，基质标准曲线与标准工作液的斜率比值分别为0.412（0 mg）、0.658（25 mg）、0.744（50 mg）、0.824（100 mg）、0.902（150 mg）和0.924（200 mg）。考虑到使用成本与基质效应的改善程度（比值0.8～1.2为可接爱范围），本研究最终选择100 mg的PSA和C18填料进行实验。
2.3 方法参数
2.3.1 标准曲线与线性范围
根据1.3.1.3节配制的标准工作溶液，对四聚乙醛在0.05～5.0 μg/L质量浓度范围内，以四聚乙醛质量浓度为横坐标（x），待测物定量离子峰面积与内标离子峰面积的比值为纵坐标（y），所得标准曲线方程为y=0.729 5x―0.025，相关系数（R2）为0.9995。标准溶液图谱见图1。
1. m/z 210.3/66.1（四聚乙醛-D16）；2. m/z 194.2/106.2（四聚乙醛）；3. m/z 194.2/62.2（四聚乙醛）。
图 1 四聚乙醛标准溶液（0.05 μg/L）（a）、鲫鱼肉空白样品（b）和添加样品（1.0 μg/kg）（c）色谱图
Fig.1 Chromatograms of metaldehyde in standard solution （a， 0.05 μg/L）， fish blank sample （b） and fortified fish sample （c， 1.0 μg/kg）
2.3.2 灵敏度
根据测定标准曲线所得的结果，配制相近质量浓度的阳性添加样品，测定其实际信噪比。以RSN=3为检测限，以RSN=10为定量限。结果表明，鸡肉样品中金刚烷胺的检出限为0.30 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。
2.3.3 准确度和精密度
取空白鲫鱼肉样品，加入标准工作溶液配制成1.0、1.5、2.0 μg/kg的加标样品，按照1.3.2节进行操作，每个添加水平重复3 次，对5 个加标样品进行定量分析。由
表2可知批内和批间的变异系数均小于10%，平均回收率均为98.5%～100.8%。
2.4 方法应用
利用该方法在2014年底对宁波市江东区大型超市所售的10 个鲫鱼样品进行了四聚乙醛残留量测定，所有样品均未检出四聚乙醛。
3 结 论
本研究建立了鱼肉中四聚乙醛测定的LC-MS/MS方法。鱼肉样品经乙腈提取，提取液经盐析后采用N-丙基乙二胺（PSA）和C18填料净化，净化液经0.1%甲酸溶液稀释后直接进行LC-MS/MS分析。该方法具有快速、灵敏、准确的特点，可适用于我国对水产品中四聚乙醛中残留分析监控要求。
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