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刘 伟 路新强
[摘要]目的：观察天然羟基磷灰石(Hydroxyaptite HA)／壳聚糖(Chitosan)复合材料(NHC)的骨组织相容性及与骨发生结合的界面情况。方法：将天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料植入兔颅骨中，用CT、三维CT和扫描电镜进行组织形态学方面的观察研究。结果：NHC植入后，植入体周围逐渐形成新骨，胶原成分逐渐成熟并减少。6个月时NHC于周围骨大部分发生融合，10个月时NHC与宿主骨发生牢固结合，成一骨性整体。结论：NHC有良好的骨组织相容性，能与骨发生骨整合。
[关键词]羟基磷灰石；壳聚糖；复合材料：骨；相容性
[中图分类号]R782．5 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)01—0031－04
天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料是由猪骨提取的并经羟基磷灰石和壳聚糖交联法获得的(该材料合成方法已获得国家专利)。其抗压强度达到人椎骨水平。理论上本复合材料同时拥有羟基磷灰石所具有的良好的生物相容性，以及引导骨形成、骨融合的特性和壳聚糖的体内降解吸收，并具有高强度、抗菌抗癌和良好的骨整合等特殊的医用生物学特性。同时长期植入体内由于壳聚糖的吸收，允许骨组织长入壳聚糖吸收后留下的位点并和羟基磷灰石交错交联骨整合在一起。为一种新复合成的材料，我们需要对其进行生物学安全评定。本文是该材料的生物学系列研究的一部分，通过扫描电镜、CT和三维CT进行观察对其骨组织相容性和其与骨组织结合的界面进行研究。
1 材料和方法
1．1实验材料：天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料由东南大学生物医学工程系吴健雄国家重点实验室吕晓迎教授生物材料研究小组完成、提供。材料制作规格为：直径10mm、高2mm的圆柱形。材料均用超声波清洗，高温高压消毒备用。
1．2动物实验
1．2．1实验动物：体重2．5kg左右新西兰大耳白兔10只，雌雄不限。
1．2．2 3％戊巴比妥钠1ml／kg兔耳缘静脉麻醉后，常规头部备皮，消毒，铺巾。做纵行长约3cm头皮切口，剥离骨膜显露顶骨，用慢钻(4000r／s)在顶骨上做直径为1．2cm圆形标准骨缺损。将材料放入骨缺损内，使材料和骨之间留有1mm的间隙，严密缝合皮肤，关闭创口。同时做无材料修复的骨缺损空白对照。术后常规40万U青霉素肌肉注射。
1．3术后检查及结果处理
1．3．1临床观察。
1．3．2术后6个月和10个月行C／和三维CT标本检测。
1．3．3术后1、4、12、24和40周各处死一只兔子。取标本，并将标本纵劈成两部分，置于2．5％戊二醛(4℃冰箱)中固定24h以上，PBS冲洗24h，1．0％锇酸固定2h，再用PBS冲洗，脱水(70％丙酮10min，90％丙酮10min，100％丙酮10min、30min、5h)，二氧化碳临界点干燥。用EIKO IB－3IONCOATER喷金。用HITACHI(日立)S-520 Scanning Electron Microanalyzer(SEM)观察材料和骨结合界面。
2 结果
2．1临床观察：术后兔生命体征平稳，手术部位无红肿、化脓。创口一期愈合。临床经过良好。术后第二日可进食，体重逐渐增加。取标本时可见，各个时期材料在位无移位；1周、4周时材料与骨固定不良，骨和材料间隙可见部分软组织成分。12周、24周时材料固定良好，间隙内软组织成分消失。40周时材料和骨固定牢固，肉眼见骨和材料直接接触，无纤维组织长入。各时期空白组均未愈合。
2．2 CT和三维CT：术后6个月、10个月进行CT和三维CT检查可直观观察到：6个月吋材料在位，骨缺损修复完好，材料和骨之间大部分直接接触，愈合良好，但仍有少部分愈合不良(图1、2)；10个月时材料完全和骨直接接触，颅骨外形恢复良好(图3、4)。
2．2 SEM观察结果：术后1周，材料和骨愈合不良，在标本制作过程中造成材料和骨的部分分离，材料和骨之间可见到软组织成分，未见骨成分(图5)。术后4周，材料和骨结合进一步牢固，但材料和骨之间可见大量软组织成分存在，局部有新类骨质形成，骨成熟度较低(图6)。术后12周，材料和骨进一步结合，结合强度增加，纤维性组织仍存在，新类骨质成分增加，缺损局部可见到骨增生突起并和材料相接触融合(图7、8)。术后24周，纤维性组织仍有少部分存留，骨性成分更多，骨成熟度较高，材料和骨结合更牢固(图9、10)。术后40周，软组织成分消失，材料和骨结合的界面可观察到直接结合，完全骨愈合，固定牢固，在材料制作过程中未见材料和骨的分离，同时可观察到骨缺损周围的骨增生并爬上材料表面，将材料部分包绕，为成熟骨(图11、12)。
3 讨论
动物体内骨组织植入实验是对材料进行功能性的动态检查，是反映材料在应用状态下的骨组织相容性的主要手段。植入材料与骨缺损边缘和新骨组织的界面结合形式是衡量该材料性能优劣的重要指标。本实验采用兔颅骨作为研究材料骨组织相容性的动物模型，其原因如下：头颅骨自身修复能力是全身骨组织中最差的，造成骨缺损不易自行修复，这有利于骨移植替代材料的研究，而且有利于观察植入材料在骨缺损修复中的作用；颅骨和颌骨胚胎学来源相似，从形态学来讲，颅骨和颌骨都是板状骨，因此颅骨和颌骨缺损的修复过程是大致相同的。本实验在兔颅骨制作直径为1．2cm大小的圆形全层标准骨缺损，排除了骨自行愈合的情况，如血块机化成骨等因素。实验中的对照组兔颅骨缺损均未发生愈合。故本实验的动物模型用于探讨材料的骨缺损修复及骨形成机制具有科学性。
大量的实验已经证明HA具有良好的软硬组织相容性，可以单独进行骨缺损的修复或作为组织工程支架材料。壳聚糖是几丁质部分脱乙酰基也是现今所发现的唯一带有正电荷的天然碱性多糖，和软骨基质糖氨多糖结构相似，具有多个可利用的活性基团，易溶于稀酸，具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且壳聚糖与HA有很强的交互作用，壳聚糖对磷酸八钙的结晶增长有显著的影响。所以推测本实验中应用的猪骨提取的天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料同样具有良好的骨组织相容性。
通过本实验证明了天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料具有良好的骨组织相容性。证据如下：动物实验术后临床经过良好，切口无红肿、感染、溢脓，伤口正常愈合，间接证明材料对机体骨组织细胞无毒性，有较好的相容性；CT和三维CT证明本材料对于颅骨缺损有良好的修复；扫描电镜观察在术后1、4周时主要是血块，无菌性炎性组织占据骨缺损间隙，材料和骨结合弱，在制作标本时材料和骨较易分离；12周、24周时材料和骨结合较强，材料未发生脱落，同时扫描电镜发现骨缺损与材料之间的间隙出现大量的新生骨质，骨质逐渐成熟，部分区域仍可见胶原成分存在，胶原成熟度逐渐增高；40周时，材料和骨发生直接的结合，骨组织成熟，周围的骨质逐渐爬上材料的表面；材料和骨结合的过程符合良好生物相容性材料骨愈合的一般过程。
骨整合是指植入材料和宿主活体骨组织发生直接结合或功能性结合。最初骨整合仅用于描述钛牙种植体的生物固定，后来延伸到其他种植材料和骨的结合方式。材料的成分和表面活性决定其和骨结合方式是纤维结合还是骨性结合。材料无毒性，无生物活性，其周围将形成不同厚度的纤维组织包被；材料无毒性，有生物活性，材料与组织之间将形成界面。在本实验中，4周到24周均发现材料周围发生新骨形成，新骨逐渐成熟，但是仍有纤维胶原成分存在包裹，并且胶原成分逐渐减少；40周时胶原成分消失，发生了完全的骨结合。故可以得出本材料无毒性，具有骨组织生物活性，具有良好的骨组织相容性。可以与骨发生直接的骨性结合。分析发生骨结合的原因是材料与骨接触的界面成分为羟基磷灰石和壳聚糖。羟基磷灰石和骨可以发生直接化学结合，产生骨基质胶原，以后进一步矿化，形成骨组织。随着时间的推移，壳聚糖刺激磷酸八钙结晶的增加，和骨交联的特性逐渐增加，纤维胶原逐渐发生钙盐沉积，不断骨化，最终在24周和40周之间实现材料和骨完全结合。
通过本试验可初步得出天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料具有良好的骨组织相容性，与骨结合界面良好。
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
[摘要]目的：观察天然羟基磷灰石(Hydroxyaptite HA)／壳聚糖(Chitosan)复合材料(NHC)的骨组织相容性及与骨发生结合的界面情况。方法：将天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料植入兔颅骨中，用CT、三维CT和扫描电镜进行组织形态学方面的观察研究。结果：NHC植入后，植入体周围逐渐形成新骨，胶原成分逐渐成熟并减少。6个月时NHC于周围骨大部分发生融合，10个月时NHC与宿主骨发生牢固结合，成一骨性整体。结论：NHC有良好的骨组织相容性，能与骨发生骨整合。
[关键词]羟基磷灰石；壳聚糖；复合材料：骨；相容性
[中图分类号]R782．5 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)01—0031－04
天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料是由猪骨提取的并经羟基磷灰石和壳聚糖交联法获得的(该材料合成方法已获得国家专利)。其抗压强度达到人椎骨水平。理论上本复合材料同时拥有羟基磷灰石所具有的良好的生物相容性，以及引导骨形成、骨融合的特性和壳聚糖的体内降解吸收，并具有高强度、抗菌抗癌和良好的骨整合等特殊的医用生物学特性。同时长期植入体内由于壳聚糖的吸收，允许骨组织长入壳聚糖吸收后留下的位点并和羟基磷灰石交错交联骨整合在一起。为一种新复合成的材料，我们需要对其进行生物学安全评定。本文是该材料的生物学系列研究的一部分，通过扫描电镜、CT和三维CT进行观察对其骨组织相容性和其与骨组织结合的界面进行研究。
1 材料和方法
1．1实验材料：天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料由东南大学生物医学工程系吴健雄国家重点实验室吕晓迎教授生物材料研究小组完成、提供。材料制作规格为：直径10mm、高2mm的圆柱形。材料均用超声波清洗，高温高压消毒备用。
1．2动物实验
1．2．1实验动物：体重2．5kg左右新西兰大耳白兔10只，雌雄不限。
1．2．2 3％戊巴比妥钠1ml／kg兔耳缘静脉麻醉后，常规头部备皮，消毒，铺巾。做纵行长约3cm头皮切口，剥离骨膜显露顶骨，用慢钻(4000r／s)在顶骨上做直径为1．2cm圆形标准骨缺损。将材料放入骨缺损内，使材料和骨之间留有1mm的间隙，严密缝合皮肤，关闭创口。同时做无材料修复的骨缺损空白对照。术后常规40万U青霉素肌肉注射。
1．3术后检查及结果处理
1．3．1临床观察。
1．3．2术后6个月和10个月行C／和三维CT标本检测。
1．3．3术后1、4、12、24和40周各处死一只兔子。取标本，并将标本纵劈成两部分，置于2．5％戊二醛(4℃冰箱)中固定24h以上，PBS冲洗24h，1．0％锇酸固定2h，再用PBS冲洗，脱水(70％丙酮10min，90％丙酮10min，100％丙酮10min、30min、5h)，二氧化碳临界点干燥。用EIKO IB－3IONCOATER喷金。用HITACHI(日立)S-520 Scanning Electron Microanalyzer(SEM)观察材料和骨结合界面。
2 结果
2．1临床观察：术后兔生命体征平稳，手术部位无红肿、化脓。创口一期愈合。临床经过良好。术后第二日可进食，体重逐渐增加。取标本时可见，各个时期材料在位无移位；1周、4周时材料与骨固定不良，骨和材料间隙可见部分软组织成分。12周、24周时材料固定良好，间隙内软组织成分消失。40周时材料和骨固定牢固，肉眼见骨和材料直接接触，无纤维组织长入。各时期空白组均未愈合。
2．2 CT和三维CT：术后6个月、10个月进行CT和三维CT检查可直观观察到：6个月吋材料在位，骨缺损修复完好，材料和骨之间大部分直接接触，愈合良好，但仍有少部分愈合不良(图1、2)；10个月时材料完全和骨直接接触，颅骨外形恢复良好(图3、4)。
2．2 SEM观察结果：术后1周，材料和骨愈合不良，在标本制作过程中造成材料和骨的部分分离，材料和骨之间可见到软组织成分，未见骨成分(图5)。术后4周，材料和骨结合进一步牢固，但材料和骨之间可见大量软组织成分存在，局部有新类骨质形成，骨成熟度较低(图6)。术后12周，材料和骨进一步结合，结合强度增加，纤维性组织仍存在，新类骨质成分增加，缺损局部可见到骨增生突起并和材料相接触融合(图7、8)。术后24周，纤维性组织仍有少部分存留，骨性成分更多，骨成熟度较高，材料和骨结合更牢固(图9、10)。术后40周，软组织成分消失，材料和骨结合的界面可观察到直接结合，完全骨愈合，固定牢固，在材料制作过程中未见材料和骨的分离，同时可观察到骨缺损周围的骨增生并爬上材料表面，将材料部分包绕，为成熟骨(图11、12)。
3 讨论
动物体内骨组织植入实验是对材料进行功能性的动态检查，是反映材料在应用状态下的骨组织相容性的主要手段。植入材料与骨缺损边缘和新骨组织的界面结合形式是衡量该材料性能优劣的重要指标。本实验采用兔颅骨作为研究材料骨组织相容性的动物模型，其原因如下：头颅骨自身修复能力是全身骨组织中最差的，造成骨缺损不易自行修复，这有利于骨移植替代材料的研究，而且有利于观察植入材料在骨缺损修复中的作用；颅骨和颌骨胚胎学来源相似，从形态学来讲，颅骨和颌骨都是板状骨，因此颅骨和颌骨缺损的修复过程是大致相同的。本实验在兔颅骨制作直径为1．2cm大小的圆形全层标准骨缺损，排除了骨自行愈合的情况，如血块机化成骨等因素。实验中的对照组兔颅骨缺损均未发生愈合。故本实验的动物模型用于探讨材料的骨缺损修复及骨形成机制具有科学性。
大量的实验已经证明HA具有良好的软硬组织相容性，可以单独进行骨缺损的修复或作为组织工程支架材料。壳聚糖是几丁质部分脱乙酰基也是现今所发现的唯一带有正电荷的天然碱性多糖，和软骨基质糖氨多糖结构相似，具有多个可利用的活性基团，易溶于稀酸，具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且壳聚糖与HA有很强的交互作用，壳聚糖对磷酸八钙的结晶增长有显著的影响。所以推测本实验中应用的猪骨提取的天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料同样具有良好的骨组织相容性。
通过本实验证明了天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料具有良好的骨组织相容性。证据如下：动物实验术后临床经过良好，切口无红肿、感染、溢脓，伤口正常愈合，间接证明材料对机体骨组织细胞无毒性，有较好的相容性；CT和三维CT证明本材料对于颅骨缺损有良好的修复；扫描电镜观察在术后1、4周时主要是血块，无菌性炎性组织占据骨缺损间隙，材料和骨结合弱，在制作标本时材料和骨较易分离；12周、24周时材料和骨结合较强，材料未发生脱落，同时扫描电镜发现骨缺损与材料之间的间隙出现大量的新生骨质，骨质逐渐成熟，部分区域仍可见胶原成分存在，胶原成熟度逐渐增高；40周时，材料和骨发生直接的结合，骨组织成熟，周围的骨质逐渐爬上材料的表面；材料和骨结合的过程符合良好生物相容性材料骨愈合的一般过程。
骨整合是指植入材料和宿主活体骨组织发生直接结合或功能性结合。最初骨整合仅用于描述钛牙种植体的生物固定，后来延伸到其他种植材料和骨的结合方式。材料的成分和表面活性决定其和骨结合方式是纤维结合还是骨性结合。材料无毒性，无生物活性，其周围将形成不同厚度的纤维组织包被；材料无毒性，有生物活性，材料与组织之间将形成界面。在本实验中，4周到24周均发现材料周围发生新骨形成，新骨逐渐成熟，但是仍有纤维胶原成分存在包裹，并且胶原成分逐渐减少；40周时胶原成分消失，发生了完全的骨结合。故可以得出本材料无毒性，具有骨组织生物活性，具有良好的骨组织相容性。可以与骨发生直接的骨性结合。分析发生骨结合的原因是材料与骨接触的界面成分为羟基磷灰石和壳聚糖。羟基磷灰石和骨可以发生直接化学结合，产生骨基质胶原，以后进一步矿化，形成骨组织。随着时间的推移，壳聚糖刺激磷酸八钙结晶的增加，和骨交联的特性逐渐增加，纤维胶原逐渐发生钙盐沉积，不断骨化，最终在24周和40周之间实现材料和骨完全结合。
通过本试验可初步得出天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料具有良好的骨组织相容性，与骨结合界面良好。
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。