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摘 要 为研究极低频连续磁场、脉冲磁场对成骨细胞的影响，采用极低频连续电磁场强度为0.05 mT、频率为50 Hz，极低频脉冲电磁场强度为0.1 mT，频率为50 Hz作用于大鼠颅骨成骨细胞，检测成骨细胞的增殖情况。结果表明连续和脉冲磁场均能提高成骨细胞的增殖。结论 连续磁场、脉冲磁场对成骨细胞均有促进作用。
关键词 连续磁场；脉冲磁场；成骨细胞；增殖
中图分类号：R35 文献标识码：A 文章编号：1671-7597（2013）22-0170-02
随着电力系统特高压趋势、各种工业电器大容量化等因素，使生产环境与生活空间电磁密度越来越强，所产生的极低频磁场强度也是前所未有的。一定强度的磁场对生物体会产生有益的影响。
200年前就有文献记载电刺激能促进骨愈合，20世纪50年代福田等发现骨组织具有压电效应，电效应是骨修复和再塑形时发挥重要作用。发展到70年代Bassett使用ELFEMF刺激治疗骨不连取得了满意的效果，之后ELFEMF与骨生长关系的研究日益增多。近年来的研究发现，治疗骨相关疾病必须选择合理的电磁场参数。
成骨细胞体外培养方法开始上世纪中期，目前已发展成为一种重要的且较为成熟的实验方法。通过体外培养成骨细胞，传代，获得相应数量的成骨细胞，进而进行一系列的实验。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
选取出生24 h内的Sprague-Dawley大鼠（购于中国医科大学实验动物中心）。
1.1.2 试剂及仪器
MTT，ConA，胎牛血清，青/链霉素混合液，完全RPMI-1640培养基。XDS系列实验室倒置生物显微镜（重庆光电仪器总公司），MCO-175 CO2培养箱（日本三洋SANYO），BBS-SDC洁净工作台（济南鑫贝生物技术有限公司），TGL-20M高速离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司），UV-1800紫外分光光度计（上海荆和分析仪器有限公司）。
1.1.3 磁场发生装置
电磁场发生器是瑞士SCHAFFNER的电磁场兼容发生器（Best EMC），线圈是标准的1 m×1 m的矩形线圈，可以产生50 Hz的磁场强度为0.05 mT的交变磁场和50 Hz磁场强度为0.1 mT的脉冲磁场，脉冲时间间隔为15 s。
1.2 方法
1.2.1 成骨细胞的培养
无菌条件下，取出生24 h内的Sprague-Dawley大鼠颅盖骨（购于中国医科大学实验动物中心），放人PBS溶液中，剔除骨表面被膜及软组织后将骨剪成小块，以1.25 g/L胰蛋白酶消化20 min，然后用含10%血清的DMEM培养基冲洗2遍，剪成1 mm×1 mm×1 mm的小骨片，接种于培养瓶中。待细胞长满培养瓶壁时传代培养，传至第2代时用差速粘附法除去成纤维细胞。取第4代成骨细胞，以每孔200 ul接种于特制的96孔培养板。
1.2.2 实验分组
将成骨细胞随机分成3组，每组包含5个亚组，即：
对照组：不外加任何磁场作用。
连续磁场组：每天按时施加0.05 mT的交变电磁场作用30 min，连续作用5天。
脉冲磁场组：每天按时施加0.1 mT的脉冲电磁场作用30 min，连续作用5天。
1.2.3 成骨细胞增殖测定
利用MTT方法测定增殖。培养结束前4小时每孔加入5μLMTT（5 mg/mL），培养到72小时结束。培养完成后，每孔加100μL二甲基亚矾，用紫外可见分光光度计测定吸光值（OD）。
1.3 统计学处理
所有数据均用平均数±标准差（±S）表示，各组均数间的差异显著性用t检验判断.（P<0.05）表示具有显著差异性，（p>0.05）表示不具有显著差异性。
2 结果
2.1 细胞形态观察及划痕实验
图1
由图1可明显看出磁场辐射组的细胞受损伤后增殖速度明显快于对照组细胞。
图2
由图2可知，细胞划伤后1小时后，6小时后，其移行能力均比对照组显著增强。
2.2 成骨细胞增殖检测
表1 强度对成骨细胞增殖的影响（%）（±S）
磁感应强度（mT） 成骨细胞增殖
对照组
连续磁场组
脉冲磁场组 0.3845±0.0012
0.4277±0.0013*
0.4398±0.0006*
*与对照组比较（p<0.05）
可以看出，连续磁场组对成骨细胞增殖为（0.4277±0.0013）与对照组（0.3845±0.0012）比较显著增加（p<0.05），脉冲磁场组（0.4398±0.0006）与对照组相比也是显著增加（p<0.05）。由此可见， 连续和脉冲磁场组均对成骨细胞的增殖有促进作用。
3 讨论
我们通过培养大鼠颅盖骨成骨细胞，用MTT法检测细胞的增殖情况，来探讨连续磁场与脉冲磁场对成骨细胞增殖作用的影响。结果显示磁场辐射组的细胞受损伤后增殖速度明显快于对照组细胞。并且通过细胞划痕实验证明其移行能力均比对照组显著增强。连续磁场组对成骨细胞增殖比对照组显著增加，脉冲磁场组与对照组相比也是显著增加。
本实验结论与许多研究者的结论相似，但也有不同之处。我们通过连续和脉冲磁场对成骨细胞进行探讨，结果证明均对成骨细胞的增殖有促进作用。通过这些研究希望电磁场对骨折愈合、肌肉扭伤等疾病有一定的治疗作用。
参考文献
[1]Fukuda E，Yasuda I.On the piezoelectric effect of bone.J Physiol Soc Jpn. 1957，12：1158-1162.
[2]Bassett CAL，Pilla AA，Pawluk RJ.A non-operative salvage of surgically-resistent pseudoarthroses and non-unions by pulsing electromagnetic fields.Clin Orthon. 1977，124：128-142.
[3]Borsalino G，Bagnacani M，Bettati E，Fornaciari F，Rocchi R，Uluhogian S，Ceccherelli G，Cadossi R，Traina GC.Electrical stimulation of human femoral intertrochameric osteolomies.Double-blind study.Clin Orthop.1988，237：256-263.
[4]Brighton CT，Shaman P，Heppenstall RB，Esterhai JL，Pollack SR，Friedenberg ZB.Tibial nonunion treated with direct current， capacitive coupling， or bone graft. Clin Ortbop.1995，321：223-234.
[5] 张建保，张晓军，文峻，屈学民.极低频电磁场对大鼠成骨细胞的影响[J].生物医学工程杂志，2007，24（5）：1058-1060.
[6]司徒正强，吴军正.细胞培养[J].西安：世界图书出版西安公司，1996：111-116.
[7]宋今丹，章静波，张世馥.组织和细胞培养技术[J].北京：人民卫生出版社，2002，97.
[8]汤青，赵南明.低频电磁场对成骨细胞增殖及细胞周期的影响[J].科学通报，1999，44（20）：2191-2194.
[9]陈国璋，姜槐.低强度极低频电磁场生物效应及特点[J].基础医学与临床，1995，15（2）：11-14.
关键词 连续磁场；脉冲磁场；成骨细胞；增殖
中图分类号：R35 文献标识码：A 文章编号：1671-7597（2013）22-0170-02
随着电力系统特高压趋势、各种工业电器大容量化等因素，使生产环境与生活空间电磁密度越来越强，所产生的极低频磁场强度也是前所未有的。一定强度的磁场对生物体会产生有益的影响。
200年前就有文献记载电刺激能促进骨愈合，20世纪50年代福田等发现骨组织具有压电效应，电效应是骨修复和再塑形时发挥重要作用。发展到70年代Bassett使用ELFEMF刺激治疗骨不连取得了满意的效果，之后ELFEMF与骨生长关系的研究日益增多。近年来的研究发现，治疗骨相关疾病必须选择合理的电磁场参数。
成骨细胞体外培养方法开始上世纪中期，目前已发展成为一种重要的且较为成熟的实验方法。通过体外培养成骨细胞，传代，获得相应数量的成骨细胞，进而进行一系列的实验。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
选取出生24 h内的Sprague-Dawley大鼠（购于中国医科大学实验动物中心）。
1.1.2 试剂及仪器
MTT，ConA，胎牛血清，青/链霉素混合液，完全RPMI-1640培养基。XDS系列实验室倒置生物显微镜（重庆光电仪器总公司），MCO-175 CO2培养箱（日本三洋SANYO），BBS-SDC洁净工作台（济南鑫贝生物技术有限公司），TGL-20M高速离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司），UV-1800紫外分光光度计（上海荆和分析仪器有限公司）。
1.1.3 磁场发生装置
电磁场发生器是瑞士SCHAFFNER的电磁场兼容发生器（Best EMC），线圈是标准的1 m×1 m的矩形线圈，可以产生50 Hz的磁场强度为0.05 mT的交变磁场和50 Hz磁场强度为0.1 mT的脉冲磁场，脉冲时间间隔为15 s。
1.2 方法
1.2.1 成骨细胞的培养
无菌条件下，取出生24 h内的Sprague-Dawley大鼠颅盖骨（购于中国医科大学实验动物中心），放人PBS溶液中，剔除骨表面被膜及软组织后将骨剪成小块，以1.25 g/L胰蛋白酶消化20 min，然后用含10%血清的DMEM培养基冲洗2遍，剪成1 mm×1 mm×1 mm的小骨片，接种于培养瓶中。待细胞长满培养瓶壁时传代培养，传至第2代时用差速粘附法除去成纤维细胞。取第4代成骨细胞，以每孔200 ul接种于特制的96孔培养板。
1.2.2 实验分组
将成骨细胞随机分成3组，每组包含5个亚组，即：
对照组：不外加任何磁场作用。
连续磁场组：每天按时施加0.05 mT的交变电磁场作用30 min，连续作用5天。
脉冲磁场组：每天按时施加0.1 mT的脉冲电磁场作用30 min，连续作用5天。
1.2.3 成骨细胞增殖测定
利用MTT方法测定增殖。培养结束前4小时每孔加入5μLMTT（5 mg/mL），培养到72小时结束。培养完成后，每孔加100μL二甲基亚矾，用紫外可见分光光度计测定吸光值（OD）。
1.3 统计学处理
所有数据均用平均数±标准差（±S）表示，各组均数间的差异显著性用t检验判断.（P<0.05）表示具有显著差异性，（p>0.05）表示不具有显著差异性。
2 结果
2.1 细胞形态观察及划痕实验
图1
由图1可明显看出磁场辐射组的细胞受损伤后增殖速度明显快于对照组细胞。
图2
由图2可知，细胞划伤后1小时后，6小时后，其移行能力均比对照组显著增强。
2.2 成骨细胞增殖检测
表1 强度对成骨细胞增殖的影响（%）（±S）
磁感应强度（mT） 成骨细胞增殖
对照组
连续磁场组
脉冲磁场组 0.3845±0.0012
0.4277±0.0013*
0.4398±0.0006*
*与对照组比较（p<0.05）
可以看出，连续磁场组对成骨细胞增殖为（0.4277±0.0013）与对照组（0.3845±0.0012）比较显著增加（p<0.05），脉冲磁场组（0.4398±0.0006）与对照组相比也是显著增加（p<0.05）。由此可见， 连续和脉冲磁场组均对成骨细胞的增殖有促进作用。
3 讨论
我们通过培养大鼠颅盖骨成骨细胞，用MTT法检测细胞的增殖情况，来探讨连续磁场与脉冲磁场对成骨细胞增殖作用的影响。结果显示磁场辐射组的细胞受损伤后增殖速度明显快于对照组细胞。并且通过细胞划痕实验证明其移行能力均比对照组显著增强。连续磁场组对成骨细胞增殖比对照组显著增加，脉冲磁场组与对照组相比也是显著增加。
本实验结论与许多研究者的结论相似，但也有不同之处。我们通过连续和脉冲磁场对成骨细胞进行探讨，结果证明均对成骨细胞的增殖有促进作用。通过这些研究希望电磁场对骨折愈合、肌肉扭伤等疾病有一定的治疗作用。
参考文献
[1]Fukuda E，Yasuda I.On the piezoelectric effect of bone.J Physiol Soc Jpn. 1957，12：1158-1162.
[2]Bassett CAL，Pilla AA，Pawluk RJ.A non-operative salvage of surgically-resistent pseudoarthroses and non-unions by pulsing electromagnetic fields.Clin Orthon. 1977，124：128-142.
[3]Borsalino G，Bagnacani M，Bettati E，Fornaciari F，Rocchi R，Uluhogian S，Ceccherelli G，Cadossi R，Traina GC.Electrical stimulation of human femoral intertrochameric osteolomies.Double-blind study.Clin Orthop.1988，237：256-263.
[4]Brighton CT，Shaman P，Heppenstall RB，Esterhai JL，Pollack SR，Friedenberg ZB.Tibial nonunion treated with direct current， capacitive coupling， or bone graft. Clin Ortbop.1995，321：223-234.
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[8]汤青，赵南明.低频电磁场对成骨细胞增殖及细胞周期的影响[J].科学通报，1999，44（20）：2191-2194.
[9]陈国璋，姜槐.低强度极低频电磁场生物效应及特点[J].基础医学与临床，1995，15（2）：11-14.