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摘要
[目的]研究石油降解固体菌肥的制备和应用。[方法]以从大港石油污染土壤筛选的石油降解细菌菌群为基础，将液体石油降解菌剂接种到麸皮和锯末质量比为1∶1的固体介质中培养，通过温度、接种量、培养时间对固体菌肥影响，制备一种活菌数量较高的石油降解固体菌肥，将其应用于不同含盐量的石油污染土壤研究其修复效果。[结果]通过分析不同温度、接种量对固体菌肥的特性的影响确定其短期内的最佳培养条件为：培养温度37 ℃、接种量为15%、培养3 d，获得固体菌肥的活菌量可达1.95×1010 cfu/ml；将石油降解固体菌肥进行60 d石油污染土壤修复表明，在含盐量为2.0、6.1 g/kg的2种土壤中，60 d修复期结束后，石油降解率分别达52.91%、34.74%。[结论]该固体菌肥适宜用于轻度盐土的石油污染土壤，并取得较好的降解效果。
关键词固体菌肥；石油降解率；制备；应用
中图分类号S181.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01810-03
Abstract [Objective] The research aimed to study the preparation and application of the petroleumdegrading solid fertilizer. [Method]Take the oildegrading bacterial community which screening petroleumcontaminated soil in Dagang as the foundation，the petroleumdegrading bacteria were inoculated into the solid medium containing the bran and the sawdust（the mass ratio of 1∶1），by temperature， inoculation amount and incubation time effect on solid fertilizer， preparing a higher number of active bacterium oildegrading solid fertilizer， applied to different amounts of petroleumcontaminated soil salinity to study its restorative effects. [Result]By analyzing the different temperature and inoculation amount of the characteristics of the solid fertilizer to determine the optimal culture conditions for its shortterm： culture temperature 37 ℃， inoculation amount 15%， cultured 3 d. The amount of active bacteria can reach 1.95×1010 cfu/ml. The solid fertilizer was used for remediation of crude oil contaminated soil， the experimental results show that under different salinity conditions， the petroleumdegrading rate in crude oil contaminated can respectively reach 52.91%、34.74% after two months of remediation. [Conclusion] The solid fertilizer is suitable for the low salt of petroleumcontaminated soil， and the effect of degradation is very well.
Key words Solid fertilizer； Petroleumdegrading rate；Preparation； Application
隨着石油使用量的不断增加，在石油生产、贮运、加工及使用过程中，由于井喷、泄漏、检修等原因导致石油烃类的溢出和排放，造成土壤石油污染[1]，给油田及周围带来了严重的环境问题。而微生物修复具有不破坏植物生长的土壤环境；对污染物能够降解完全，并将有机物转化为无害的CO2和H2O，避免二次污染；处理形式多样；成本明显低于物理和化学法处理等优点，已经越来越受到人们的重视[2-5]。由于液体石油降解菌群在保存、运输和活性保存等方面存在诸多问题，因此，将微生物固定在载体上以获得高效、易于保存的固体菌肥是生物修复的一个很有前景的方向。
目前，关于石油污染土壤修复的研究大部分集中在石油降解菌株的筛选、石油降解机理以及土壤修复工艺方面，这些研究逐步证实了石油污染土壤微生物修复的可行性，但石油降解固体菌肥的研究较少。向石油污染土壤中投加高效生物菌肥是一种切实可行的原位修复技术，该技术在国外起步较早，已开发出多种商品生物菌剂[6]，并应用于实际的修复工程中，取得良好的修复效果[7-8]。
在我国研究较多的微生物菌肥主要涉及根瘤菌肥料、固氮菌肥料、磷细菌肥料，并制定了微生物肥料的农业行业标准[9]。关于石油污染土壤修复的石油降解固体菌肥的相关报道较少，在我国处于研发阶段，但研究表明修复效果较好。胥九兵等将2种石油降解细菌菌剂接种到草炭和麸皮的固态培养基中培养，制备BC-E和BC-I 2种菌剂，并采用研制的菌剂对石油污染土壤进行修复试验，结果表明1个月污染土壤中的石油降解率可达45%[10]。于勇勇等将菌液、油砂、锯末和发酵后的农家肥混合，进行降解试验，发现经过56 d的处理，菌剂强化处理单元最终油去除率达47.4%[11]。笔者以从大港石油污染土壤筛选的石油降解细菌菌群为基础，选择麸皮和锯末作为固态培养的营养源和载体，通过温度、接种量、培养时间对固体菌肥影响，制备一种活菌数量较高的石油降解固体菌肥，将其应用于不同含盐量的石油污染土壤研究其修复效果，以期为现场石油污染盐碱土壤微生物修复提供理论依据。 1材料与方法
1.1材料
1.1.1
试验选材。试验用土壤取自天津理工大学校园土，加入原油配置成石油浓度为5 500 mg/kg的石油污染土壤。液体菌剂为高效石油降解细菌菌群，菌群经该实验室通过采自天津大港油田石油污染土壤，筛选驯化后获得[12]。麸皮是优良的固态发酵的天然原料，含有易于微生物利用的丰富的碳氮源；锯末持水力强，通透性好，有利于氧的传输，为微生物的生长提供有利的降解条件，同时也是良好的土壤改良剂，因此选择麸皮和锯末为菌肥的固体介质。
1.1.2
培养基的选择。试验过程中使用的液体LB培养基为蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 000 ml、pH 7.0，固体LB培养基为蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 000 ml、pH 7.0、琼脂18 g。
1.2石油降解固体菌肥的制备方法
将保存的高效石油降解菌群活化，以灭菌的麸皮、锯末为固体介质进行培养，通过研究不同接种量、温度、培养时间对固体菌肥特性的影响确定最优培养条件，以此制备固体菌肥，为生产实践奠定基础。将石油降解菌群按10%、15%、30%的接种量分别接入灭菌的固体介质（麸皮和锯末质量比为1∶1）中，维持60%含水率，分别在室温（春末夏初11～16 ℃）下、37 ℃下培养并测其在培养过程中的pH和细菌数量。
2.1.1
固体菌肥培养过程中pH的变化。从图1可以看出，对于室温、37 ℃，在接种量10%、15%、30%的条件下，pH呈现相似的规律，随着培养时间的增加pH不断上升；在7 d的培养过程中，在2种温度下，3个接种量的（接种量由低到高）pH变化幅度均不大，室温下分别是0.45、0.14、0.12，37 ℃下分别是0.39、0.44、0.44。2种温度下，固体菌肥中pH均升高，造成pH升高的原因可能是由于微生物生长需要适宜的酸碱环境，在利用固体介质和培养基中的营养物质过程中，产生一些物质导致了菌液中pH的升高，以此营造有利的生长环境；pH变化幅度不大，主要原因可能是固体介质本身具有缓冲能力，使其在微生物适宜生长的pH范围内波动。可以初步判断在整个固体菌肥培养过程中，温度、接种量对菌液中pH具有一定的影响。
2.1.2
固体菌肥培养过程中细菌数量的变化。从图2可以看出，在不同培养温度（室温和37 ℃）和不同接种量的大小情况下，固体菌肥中的微生物数量随培养时间的变化趋势出现相似的规律，即在0～7 d微生物数量呈现迅速上升并逐渐达到稳定的趋势，均可达109 cfu/ml；细菌在3个接种量下，均有较为理想的长势，培养到1 d时微生物在数量级上均保持在109 cfu/ml，这在一定程度上说明将微生物接入到固体介质中，微生物能够较快适应该体系，并开始利用其中的营养物质提供自身生长。
2.1.2.1
不同培养温度下。从不同培养温度对比上看，在3种接种量（分别为10%、15%、30%）下，在7 d培养过程中，37 ℃培养下的微生物数量均比室温下的高，说明37 ℃较室温更适宜微生物的生长；在2种温度下，0～3 d内微生物数量上升均很快，这在一定程度上说明将微生物接入到固体介质中，微生物能够较快适应该体系，并开始利用其中的营养物质提供自身生长。在室温培养，3种接种量条件下，在0～3 d微生物数量快速增加，3～7 d趋向平衡，7 d后均达109 cfu/ml；在37 ℃培养，3种接种量条件下，在0～3 d微生物数量快速增加达到最大值，均达1010cfu/ml，3～7 d有下降的趋势。造成这一现象的主要原因是初期微生物能够较快适应固体介质环境，利用其中的营养物质提供自身生长进行大量的繁殖；在3～7 d时，可能是固体介质和培养基中的营养物质不能满足大量繁殖的微生物生长，微生物开始出现死亡呈现出下降的趋势。
2.2石油降解固体菌肥的石油污染土壤修复应用研究
将石油降解固体菌肥应用于石油污染盐碱土壤中，研究其修复能力。将固体菌肥以10%的接种量添加到不同含盐量的石油污染土壤中，根据盐渍化土壤的划分标准[15]，石油污染土壤的含盐量设计为轻度盐土2.0 g/kg、重度盐土6.1 g/kg，进行60 d的生物修复，测得各时期土壤石油含量、细菌数量、含盐量、pH。
安徽农业科学2014年
2.2.1
土壤中石油降解率。从图3可以看出，在不加菌肥的土壤（作為空白对比）中，石油在土著微生物作用下逐步降解，60 d的修复期结束后，含盐量为2.0、6.1 g/kg的2种土壤中石油降解率分别达11.27%、8.09%。添加固体菌肥后，在2种盐分条件下，随着时间的增加，土壤中石油降解率在不断的增加；在0～35 d内，石油降解率变化幅度较大，在35～60 d内石油降解率趋向平稳；在低盐条件下的石油降解率高于高盐条件，在15 d时，2种含盐量下的石油降解率分别为23.09%、11.58%，说明在短期内微生物对石油有一定程度的降解效果；在第35天时，2种盐分的土壤中石油降解率分别达4600%、28.13%；50 d时，石油降解率变化幅度开始变小，石油降解率分别达50.36%、32.90%，低盐条件下的石油降解率比高盐条件下高17.46%；60 d修复期结束后，石油降解率分别达52.91%、34.74%。
3结论
（1）通过将液体石油降解菌剂接种到麸皮和锯末质量比为1∶1的固体介质中培养，以此来制备石油降解固体菌肥。通过分析不同温度（室温、37 ℃恒温）、接种量（10%、15%、30%）对固体菌肥的特性的影响，确定其短期内的最佳培养条件为：培养温度37 ℃、接种量为15%、培养3 d，获得固体
（2）将石油降解固体菌肥应用于不同含盐量的石油污染土壤中，对其进行了60 d的生物修复，结果表明，在含盐量为2.0、6.1 g/kg的2种土壤中，60 d修复期结束后，固体菌肥对石油的降解率分别达52.91%、34.74%，该固体菌肥适于轻度盐碱石油污染土壤；其修复效果明显优于自然降解，固体菌肥发挥了显著作用。 （3）固体菌肥的应用受外界因素影响较大，温度、土壤湿度、盐碱性、空气的流通性的差异均会不同程度地影响到固体菌肥对石油的降解能力。因此，在未来的实际应用时还需要考虑固体菌肥的的最佳使用方法、条件，使固体菌肥发挥最大效力。
参考文献
[1]
齐永强，王红旗.微生物处理土壤石油污染的研究进展[J].上海环境科学，2002，50（20）：4125-4128.
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[3] 刘五星，骆永明，滕应，等.石油污染土壤的生物修复研究进展[J].土壤，2006， 38 （5）： 634-639.
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[7] GENTILI A R，CUBITTO M A，RODRIGUEZ M S.Bioremediation of crude oil plluted seawater by a hydrocarbon degrading bacterial strain immobilized on chitin and chitosan flakes[J]. Int Biodeterior Biodegrad，2006，57：222-228.
[8] DZULPUC J D，ESPARZAGARCIA F，BARAJASACEVES M，et al.Benzo[a]pyrene removal from soil by Phanerochaete chrysosporium grown on sugarcane bagasse and pine sawdust[J].Chemosphere，2005，58：1-7.
[9] 農业部中国农科院土肥所.NY 227-94，微生物肥料[S].北京：中国标准出版社，1994.
[10] 胥九兵，迟建国，邱维忠，等.石油降解菌剂的研制及其在石油污染土壤修复中的应用[J].生物加工过程，2009，7（6）：21-24.
[11] 于勇勇，丁爱中，欧阳威，等.微生物菌剂强化处理油砂[J].化工环保，2006，26（3）：218-221.
[12] WANG Z R，LI Y N，ZHU X Y，et al.Experimental Study on Oil-degradation Microbial Consortium from Oil-contaminated Soil by Different Enrichment and Domestication[J].Advanced Materials Research，2013，779/780：1304-1308.
[13] 俞毓馨，吴国庆，孟宪庭.环境工程微生物检验手册[K].北京：中国环境科学出版社，1990：216-21.
[14] 中国林业科学研究院林业研究所森林土壤研究室.森林土壤水溶性盐分分析LY/T 1251-1999[S].北京：中国标准出版社，1999.
[15] 王遵亲，祝寿泉，俞仁培.中国盐渍土[M].北京：科学出版社，1993.
[目的]研究石油降解固体菌肥的制备和应用。[方法]以从大港石油污染土壤筛选的石油降解细菌菌群为基础，将液体石油降解菌剂接种到麸皮和锯末质量比为1∶1的固体介质中培养，通过温度、接种量、培养时间对固体菌肥影响，制备一种活菌数量较高的石油降解固体菌肥，将其应用于不同含盐量的石油污染土壤研究其修复效果。[结果]通过分析不同温度、接种量对固体菌肥的特性的影响确定其短期内的最佳培养条件为：培养温度37 ℃、接种量为15%、培养3 d，获得固体菌肥的活菌量可达1.95×1010 cfu/ml；将石油降解固体菌肥进行60 d石油污染土壤修复表明，在含盐量为2.0、6.1 g/kg的2种土壤中，60 d修复期结束后，石油降解率分别达52.91%、34.74%。[结论]该固体菌肥适宜用于轻度盐土的石油污染土壤，并取得较好的降解效果。
关键词固体菌肥；石油降解率；制备；应用
中图分类号S181.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01810-03
Abstract [Objective] The research aimed to study the preparation and application of the petroleumdegrading solid fertilizer. [Method]Take the oildegrading bacterial community which screening petroleumcontaminated soil in Dagang as the foundation，the petroleumdegrading bacteria were inoculated into the solid medium containing the bran and the sawdust（the mass ratio of 1∶1），by temperature， inoculation amount and incubation time effect on solid fertilizer， preparing a higher number of active bacterium oildegrading solid fertilizer， applied to different amounts of petroleumcontaminated soil salinity to study its restorative effects. [Result]By analyzing the different temperature and inoculation amount of the characteristics of the solid fertilizer to determine the optimal culture conditions for its shortterm： culture temperature 37 ℃， inoculation amount 15%， cultured 3 d. The amount of active bacteria can reach 1.95×1010 cfu/ml. The solid fertilizer was used for remediation of crude oil contaminated soil， the experimental results show that under different salinity conditions， the petroleumdegrading rate in crude oil contaminated can respectively reach 52.91%、34.74% after two months of remediation. [Conclusion] The solid fertilizer is suitable for the low salt of petroleumcontaminated soil， and the effect of degradation is very well.
Key words Solid fertilizer； Petroleumdegrading rate；Preparation； Application
隨着石油使用量的不断增加，在石油生产、贮运、加工及使用过程中，由于井喷、泄漏、检修等原因导致石油烃类的溢出和排放，造成土壤石油污染[1]，给油田及周围带来了严重的环境问题。而微生物修复具有不破坏植物生长的土壤环境；对污染物能够降解完全，并将有机物转化为无害的CO2和H2O，避免二次污染；处理形式多样；成本明显低于物理和化学法处理等优点，已经越来越受到人们的重视[2-5]。由于液体石油降解菌群在保存、运输和活性保存等方面存在诸多问题，因此，将微生物固定在载体上以获得高效、易于保存的固体菌肥是生物修复的一个很有前景的方向。
目前，关于石油污染土壤修复的研究大部分集中在石油降解菌株的筛选、石油降解机理以及土壤修复工艺方面，这些研究逐步证实了石油污染土壤微生物修复的可行性，但石油降解固体菌肥的研究较少。向石油污染土壤中投加高效生物菌肥是一种切实可行的原位修复技术，该技术在国外起步较早，已开发出多种商品生物菌剂[6]，并应用于实际的修复工程中，取得良好的修复效果[7-8]。
在我国研究较多的微生物菌肥主要涉及根瘤菌肥料、固氮菌肥料、磷细菌肥料，并制定了微生物肥料的农业行业标准[9]。关于石油污染土壤修复的石油降解固体菌肥的相关报道较少，在我国处于研发阶段，但研究表明修复效果较好。胥九兵等将2种石油降解细菌菌剂接种到草炭和麸皮的固态培养基中培养，制备BC-E和BC-I 2种菌剂，并采用研制的菌剂对石油污染土壤进行修复试验，结果表明1个月污染土壤中的石油降解率可达45%[10]。于勇勇等将菌液、油砂、锯末和发酵后的农家肥混合，进行降解试验，发现经过56 d的处理，菌剂强化处理单元最终油去除率达47.4%[11]。笔者以从大港石油污染土壤筛选的石油降解细菌菌群为基础，选择麸皮和锯末作为固态培养的营养源和载体，通过温度、接种量、培养时间对固体菌肥影响，制备一种活菌数量较高的石油降解固体菌肥，将其应用于不同含盐量的石油污染土壤研究其修复效果，以期为现场石油污染盐碱土壤微生物修复提供理论依据。 1材料与方法
1.1材料
1.1.1
试验选材。试验用土壤取自天津理工大学校园土，加入原油配置成石油浓度为5 500 mg/kg的石油污染土壤。液体菌剂为高效石油降解细菌菌群，菌群经该实验室通过采自天津大港油田石油污染土壤，筛选驯化后获得[12]。麸皮是优良的固态发酵的天然原料，含有易于微生物利用的丰富的碳氮源；锯末持水力强，通透性好，有利于氧的传输，为微生物的生长提供有利的降解条件，同时也是良好的土壤改良剂，因此选择麸皮和锯末为菌肥的固体介质。
1.1.2
培养基的选择。试验过程中使用的液体LB培养基为蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 000 ml、pH 7.0，固体LB培养基为蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 000 ml、pH 7.0、琼脂18 g。
1.2石油降解固体菌肥的制备方法
将保存的高效石油降解菌群活化，以灭菌的麸皮、锯末为固体介质进行培养，通过研究不同接种量、温度、培养时间对固体菌肥特性的影响确定最优培养条件，以此制备固体菌肥，为生产实践奠定基础。将石油降解菌群按10%、15%、30%的接种量分别接入灭菌的固体介质（麸皮和锯末质量比为1∶1）中，维持60%含水率，分别在室温（春末夏初11～16 ℃）下、37 ℃下培养并测其在培养过程中的pH和细菌数量。
2.1.1
固体菌肥培养过程中pH的变化。从图1可以看出，对于室温、37 ℃，在接种量10%、15%、30%的条件下，pH呈现相似的规律，随着培养时间的增加pH不断上升；在7 d的培养过程中，在2种温度下，3个接种量的（接种量由低到高）pH变化幅度均不大，室温下分别是0.45、0.14、0.12，37 ℃下分别是0.39、0.44、0.44。2种温度下，固体菌肥中pH均升高，造成pH升高的原因可能是由于微生物生长需要适宜的酸碱环境，在利用固体介质和培养基中的营养物质过程中，产生一些物质导致了菌液中pH的升高，以此营造有利的生长环境；pH变化幅度不大，主要原因可能是固体介质本身具有缓冲能力，使其在微生物适宜生长的pH范围内波动。可以初步判断在整个固体菌肥培养过程中，温度、接种量对菌液中pH具有一定的影响。
2.1.2
固体菌肥培养过程中细菌数量的变化。从图2可以看出，在不同培养温度（室温和37 ℃）和不同接种量的大小情况下，固体菌肥中的微生物数量随培养时间的变化趋势出现相似的规律，即在0～7 d微生物数量呈现迅速上升并逐渐达到稳定的趋势，均可达109 cfu/ml；细菌在3个接种量下，均有较为理想的长势，培养到1 d时微生物在数量级上均保持在109 cfu/ml，这在一定程度上说明将微生物接入到固体介质中，微生物能够较快适应该体系，并开始利用其中的营养物质提供自身生长。
2.1.2.1
不同培养温度下。从不同培养温度对比上看，在3种接种量（分别为10%、15%、30%）下，在7 d培养过程中，37 ℃培养下的微生物数量均比室温下的高，说明37 ℃较室温更适宜微生物的生长；在2种温度下，0～3 d内微生物数量上升均很快，这在一定程度上说明将微生物接入到固体介质中，微生物能够较快适应该体系，并开始利用其中的营养物质提供自身生长。在室温培养，3种接种量条件下，在0～3 d微生物数量快速增加，3～7 d趋向平衡，7 d后均达109 cfu/ml；在37 ℃培养，3种接种量条件下，在0～3 d微生物数量快速增加达到最大值，均达1010cfu/ml，3～7 d有下降的趋势。造成这一现象的主要原因是初期微生物能够较快适应固体介质环境，利用其中的营养物质提供自身生长进行大量的繁殖；在3～7 d时，可能是固体介质和培养基中的营养物质不能满足大量繁殖的微生物生长，微生物开始出现死亡呈现出下降的趋势。
2.2石油降解固体菌肥的石油污染土壤修复应用研究
将石油降解固体菌肥应用于石油污染盐碱土壤中，研究其修复能力。将固体菌肥以10%的接种量添加到不同含盐量的石油污染土壤中，根据盐渍化土壤的划分标准[15]，石油污染土壤的含盐量设计为轻度盐土2.0 g/kg、重度盐土6.1 g/kg，进行60 d的生物修复，测得各时期土壤石油含量、细菌数量、含盐量、pH。
安徽农业科学2014年
2.2.1
土壤中石油降解率。从图3可以看出，在不加菌肥的土壤（作為空白对比）中，石油在土著微生物作用下逐步降解，60 d的修复期结束后，含盐量为2.0、6.1 g/kg的2种土壤中石油降解率分别达11.27%、8.09%。添加固体菌肥后，在2种盐分条件下，随着时间的增加，土壤中石油降解率在不断的增加；在0～35 d内，石油降解率变化幅度较大，在35～60 d内石油降解率趋向平稳；在低盐条件下的石油降解率高于高盐条件，在15 d时，2种含盐量下的石油降解率分别为23.09%、11.58%，说明在短期内微生物对石油有一定程度的降解效果；在第35天时，2种盐分的土壤中石油降解率分别达4600%、28.13%；50 d时，石油降解率变化幅度开始变小，石油降解率分别达50.36%、32.90%，低盐条件下的石油降解率比高盐条件下高17.46%；60 d修复期结束后，石油降解率分别达52.91%、34.74%。
3结论
（1）通过将液体石油降解菌剂接种到麸皮和锯末质量比为1∶1的固体介质中培养，以此来制备石油降解固体菌肥。通过分析不同温度（室温、37 ℃恒温）、接种量（10%、15%、30%）对固体菌肥的特性的影响，确定其短期内的最佳培养条件为：培养温度37 ℃、接种量为15%、培养3 d，获得固体
（2）将石油降解固体菌肥应用于不同含盐量的石油污染土壤中，对其进行了60 d的生物修复，结果表明，在含盐量为2.0、6.1 g/kg的2种土壤中，60 d修复期结束后，固体菌肥对石油的降解率分别达52.91%、34.74%，该固体菌肥适于轻度盐碱石油污染土壤；其修复效果明显优于自然降解，固体菌肥发挥了显著作用。 （3）固体菌肥的应用受外界因素影响较大，温度、土壤湿度、盐碱性、空气的流通性的差异均会不同程度地影响到固体菌肥对石油的降解能力。因此，在未来的实际应用时还需要考虑固体菌肥的的最佳使用方法、条件，使固体菌肥发挥最大效力。
参考文献
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[8] DZULPUC J D，ESPARZAGARCIA F，BARAJASACEVES M，et al.Benzo[a]pyrene removal from soil by Phanerochaete chrysosporium grown on sugarcane bagasse and pine sawdust[J].Chemosphere，2005，58：1-7.
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