论文部分内容阅读
【摘要】目的：建立HPLC法测定鳖甲消痔胶囊中没食子酸的含量。方法：采用ThermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）;流动相为甲醇-0.025%磷酸溶液（4.5∶95.5），流速1.0mL/min，检测波长为272nm;柱温25℃。结果：没食子酸在0.9316～46.58μg/mL范围内呈良好线性关系，r=1.0000;平均回收率为99.8%，RSD=1.4%（n=6）。结论：该方法简捷，快速，可靠，可用于控制制剂的质量。
【关键词】鳖甲消痔胶囊;没食子酸;含量测定;高效液相色谱法
【中图分类号】R917【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）1-0036-03
Abstract：ObjectiveToestablishamethodofthecontentdeterminationofgallicacidintheAojiaxiaozhicapsulebyHPLC.MethodThermoC18column（250mm×4.6mm，5μm）wasadopted.Themobilephasewasmethanoland0.025%phosphoricacidsolution（4.5∶[KG-*3/5]95.5），withtheflowrateof1.0mL/min，anddetectionwavelengthof272nm.Thecolumntemperaturewas25℃.ResultsTherewasagoodlinearityintherangeof0.9～186.3μg/mL，r=1.0000.Theaveragerecoverywas100.3%，withRSDof1.9%（n=6）.ConclusionThemethodissimple，rapidandreliable.ItcouldbeusedtocontrolthequalityoftheAojiaxiaozhicapsule.
Keywords：AojiaxiaozhiCapsule;GallicAcid;ContentDetermination;HPLC
鳖甲消痔胶囊由地榆、地瓜藤、黄柏、土大黄、鳖甲、槐角、忍冬藤、梔子八味中药配伍而成，具有清热解毒、凉血止血、消肿止痛的功效。用于湿热蕴结所致的内痔出血、外痔肿痛、肛周瘙痒。文献查询发现，目前对该制剂的研究主要有：用TLC法对大黄、地榆、槐角、栀子进行鉴别;用高效液相色谱法测定制剂中盐酸小檗碱的含量[1-2]。为了进一步研究该制剂，笔者选取该制剂中一种臣药地榆，建立HPLC法测定地榆中没食子酸的含量。地榆属蔷薇科植物，采挖后除去须根，洗净，干燥，或趁鲜切片，干燥。具有凉血止血、解毒敛疮之功效，用于便血、痔血、血痢、崩漏、痈肿疮毒等症。有文献[3-4]对地榆的抗炎抑菌作用进行了研究，研究表明地榆对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草杆菌、变形杆菌，甲型链球菌等细菌具有很好抑制作用。地榆中化学成分主要为鞣质类、三萜皂苷类、黄酮类[5]，其中鞣质类化合物是地榆的主要有效成分，没食子酸是鞣质的重要组成成分，也是评价地榆质量的主要指标[6]。没食子酸是自然界中广泛存在的一种多酚类化合物。有研究表明，没食子酸具有止血、抗炎、抗突变、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、杀锥虫等多种生物活性[7-8]。有研究证实没食子酸体外对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用[9-10]。本实验建立高效液相色谱法测定鳖甲消痔胶囊中没食子酸含量。
1仪器与试药
1.1仪器AgiLent1260高效液相色谱仪（配置四元泵、自动进样器、UV检测器）;ThermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）;XS105电子分析天平（梅特勒上海公司）。
1.2试药没食子酸（90.1%，批号：110831-200803，中国食品药品检定研究院）。鳖甲消痔胶囊（批号：1511014、1511038、2576004，贵州汉方药业有限公司）。流动相用试剂为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱：ThermoC18（250×4.6mm，5μm;流动相：流动相0.025%磷酸-甲醇（95.5∶4.5）;流速1.0mL/min;检测波长272nm;柱温25℃;进样量：5μL。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液制备精密称取没食子酸10.34mg置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.1863mg/mL没食子酸储备液。精密吸取没食子酸储备液5mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得没食子酸对照品使用液。
2.2.2供试品溶液制备取鳖甲消痔胶囊20粒，精密称定，混匀，取约0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10%盐酸溶液10mL，振摇，加入30mL纯化水，摇匀，置于电炉上煮沸20min，取下，冷却至室温，过滤，收集滤液置于50mL容量瓶中。用水洗涤滤渣，合并滤液于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2.2.3阴性样品制备按处方各药材比例及制法，制得不含地榆的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。
2.3系统适用性试验分别取供试品溶液、对照品溶液，按上述色谱条件实验，对系统适用参数进行考察，没食子酸理论板数为6893。理论板数大于2000[1]。
2.4线性关系考察分别精密吸取2.2.1项下的没食子酸对照品使用液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0mL，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度;摇匀，即得系列质量浓度的对照品溶液。在2.1项下的色谱条件下测定。以没食子酸浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，经线性回归，回归方程为Y=17.0217X-3.6469，r=1.0000。结果表明：没食子酸在0.9316～46.58μg/mL范围内具有良好的线性关系。对照品、供试品、阴性对照的色谱图见图1。 2.5精密度试验取同一浓度的对照品溶液，在2.1項色谱条件下连续进样测定6次，记录没食子酸峰面积，其RSD为0.8%（n=6）。
2.6稳定性试验取同一在2.2.2项下制备的样品，在2.1项下色谱条件下分别于2、4、8、16、24h进样5μL，记录峰面积，结果测得没食子酸峰面积RSD为0.8%。表明样品在24h稳定。
2.7重复性试验取同一批号样品（批号：2576004），按照2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，在2.1项色谱条件下测定，测得没食子酸含有量RSD为1.2%（n=6）。
2.8加样回收率试验精密称取含有量已知的鳖甲消痔胶囊（批号2576004）6份，每份约0.4g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入浓度为0.4209mg/mL的没食子酸对照品溶液2.5mL，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，计算回收率，结果见表1。
2.9样品测定结果取鳖甲消痔胶囊20粒，精密称定，混匀，取约0.8g，精密称定，平行3份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下测定，计算含有量，结果见表2。
3讨论
3.1检测波长的选择取没食子酸对照品溶液在200～400nm范围内进行紫外扫描，没食子酸在272nm处有最大吸收，与中国药典地榆含量测定项下选用波长一致，故选择272nm为检测波长。
3.2流动相的选择首先尝试了甲醇和水做流动相，经进样检测，结果峰型不好，然后参考中国药典[1]地榆含量项下流动相甲醇-0.05%磷酸溶液（5∶95），发现峰型变好，但目标峰与相邻的杂峰分离不是很好，而且杂峰较多，查阅相关文献[11-13]，改变磷酸溶液浓度为0.025%，发现峰型变好，分离度符合要求，故选择0.025%磷酸-甲醇（4.5∶95.5）作为流动相。
3.3提取方式的选择通过参考中国药典[1]和文献[14-15]，尝试用水和不同浓度（30%、50%、70%）的乙醇作为提取溶剂，煮沸和回流两种提取方式，提取时间（10min、20min、30min、40min）。结果用水做溶剂通过煮沸含量较高，三种不同浓度乙醇回流含量无明显差异且比水煮沸含量低。提取时间20min、30min、40min含量无明显变化。但同时发现以上几种提取出的供试品中目标峰型较差，而且杂峰多，查阅相关文献[16-17]了解到PH对没食子酸稳定性影响较大，没食子酸在酸性条件下稳定，随PH值增加稳定性逐渐下降，碱性条件下极不稳定。尝试加入不同浓度（2%、5%、10%、15%）的盐酸溶液。盐酸溶液加入体积有5、10mL两种。结果发现加入10%盐酸溶液10mL，没食子酸含量测定值最高且与加入15%盐酸溶液10mL无明显差异。综合以上实验，确定了本法的提取方式。
参考文献
[1]孙芳.鳖甲消痔胶囊质量标准研究[J].湖南中医药大学学报，2007，8（27）：239-240.
[2]童红，杨永东，王海宁.HPLC测定鳖甲消痔胶囊中盐酸小檗碱的含量[J].贵阳中医学院学报，2001，6（23）：63-64.
[3]吴开云.冰片、虎杖、地榆抑菌作用的实验研究[J].江西医学院学报，1996，36（3）：53-55.
[4]周本宏，松长青，姜珊，等.地榆鞣质提取物的抗菌活性及对金黄色葡萄球菌的抑菌机制研究[J].中国药师，2016，19（3）：464-469.
[5]程东亮，曹小平，邹佩秀，等.中药地榆黄酮等成分的分离和鉴定[J].中草药，1995，261（11）：570-571.
[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：126.
[7]KoideT，NoseM，InoueM，etal.Trypanocidaleffectsofgallicacidandrelatedcompands[J].Plantamed，1998，64（1）：27-30.
[8]LocatecliC，RossoR，MariaC，eral.EsterderivativesofgallicacidwithpotentialtoxicitytowardL1210leukemiacells[J].BioorganicandwithPotentialMedicinalchemistry，2008，16（1）：3791-3799.
[9]高伦江.余甘子抑菌活性及防腐应用活性研究[D].重庆：西南大学，2008.
[10]刘延麟.没食子酸单体化合物分离鉴定及药理活性研究[D].长春：吉林大学，2008.
[11]刘利军，李瑞莲.反相高效液相色谱法测定地榆药材中没食子酸的含量[J].中国药师，2009，12（7）：797-980.
[12]沙明，曹爱民，王冰，等.高效液相色谱法测定地榆没食子酸的含量[J].国药杂志，1999，24（2）：99-100.
[13]刘志贤.高效液相色谱法测定地榆中没食子酸的含量[J].临床经验与体会，2004，21（2）：164.
[14]蓝海，李龙星，肖培云.紫地榆中没食子酸的提取工艺研究[J].中成药，2009，31（9）：1456-1457.
[15]常连举，张宗和，黄嘉玲，等.没食子酸的制备与应用综述[J].生物质化学工程，2010，44（4）：48-51.
[16]王广娟.五倍子没食子酸的提取、纯化及抑菌效果研究[D].保定：河北农业大学，2010.
[17]瞿燕.五倍子发酵工艺及药理实验研究[D].成都：成都中医药大学，2002.
（收稿日期：2018-07-13编辑：刘斌）
【关键词】鳖甲消痔胶囊;没食子酸;含量测定;高效液相色谱法
【中图分类号】R917【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）1-0036-03
Abstract：ObjectiveToestablishamethodofthecontentdeterminationofgallicacidintheAojiaxiaozhicapsulebyHPLC.MethodThermoC18column（250mm×4.6mm，5μm）wasadopted.Themobilephasewasmethanoland0.025%phosphoricacidsolution（4.5∶[KG-*3/5]95.5），withtheflowrateof1.0mL/min，anddetectionwavelengthof272nm.Thecolumntemperaturewas25℃.ResultsTherewasagoodlinearityintherangeof0.9～186.3μg/mL，r=1.0000.Theaveragerecoverywas100.3%，withRSDof1.9%（n=6）.ConclusionThemethodissimple，rapidandreliable.ItcouldbeusedtocontrolthequalityoftheAojiaxiaozhicapsule.
Keywords：AojiaxiaozhiCapsule;GallicAcid;ContentDetermination;HPLC
鳖甲消痔胶囊由地榆、地瓜藤、黄柏、土大黄、鳖甲、槐角、忍冬藤、梔子八味中药配伍而成，具有清热解毒、凉血止血、消肿止痛的功效。用于湿热蕴结所致的内痔出血、外痔肿痛、肛周瘙痒。文献查询发现，目前对该制剂的研究主要有：用TLC法对大黄、地榆、槐角、栀子进行鉴别;用高效液相色谱法测定制剂中盐酸小檗碱的含量[1-2]。为了进一步研究该制剂，笔者选取该制剂中一种臣药地榆，建立HPLC法测定地榆中没食子酸的含量。地榆属蔷薇科植物，采挖后除去须根，洗净，干燥，或趁鲜切片，干燥。具有凉血止血、解毒敛疮之功效，用于便血、痔血、血痢、崩漏、痈肿疮毒等症。有文献[3-4]对地榆的抗炎抑菌作用进行了研究，研究表明地榆对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草杆菌、变形杆菌，甲型链球菌等细菌具有很好抑制作用。地榆中化学成分主要为鞣质类、三萜皂苷类、黄酮类[5]，其中鞣质类化合物是地榆的主要有效成分，没食子酸是鞣质的重要组成成分，也是评价地榆质量的主要指标[6]。没食子酸是自然界中广泛存在的一种多酚类化合物。有研究表明，没食子酸具有止血、抗炎、抗突变、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、杀锥虫等多种生物活性[7-8]。有研究证实没食子酸体外对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用[9-10]。本实验建立高效液相色谱法测定鳖甲消痔胶囊中没食子酸含量。
1仪器与试药
1.1仪器AgiLent1260高效液相色谱仪（配置四元泵、自动进样器、UV检测器）;ThermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）;XS105电子分析天平（梅特勒上海公司）。
1.2试药没食子酸（90.1%，批号：110831-200803，中国食品药品检定研究院）。鳖甲消痔胶囊（批号：1511014、1511038、2576004，贵州汉方药业有限公司）。流动相用试剂为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱：ThermoC18（250×4.6mm，5μm;流动相：流动相0.025%磷酸-甲醇（95.5∶4.5）;流速1.0mL/min;检测波长272nm;柱温25℃;进样量：5μL。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液制备精密称取没食子酸10.34mg置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.1863mg/mL没食子酸储备液。精密吸取没食子酸储备液5mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得没食子酸对照品使用液。
2.2.2供试品溶液制备取鳖甲消痔胶囊20粒，精密称定，混匀，取约0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10%盐酸溶液10mL，振摇，加入30mL纯化水，摇匀，置于电炉上煮沸20min，取下，冷却至室温，过滤，收集滤液置于50mL容量瓶中。用水洗涤滤渣，合并滤液于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2.2.3阴性样品制备按处方各药材比例及制法，制得不含地榆的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。
2.3系统适用性试验分别取供试品溶液、对照品溶液，按上述色谱条件实验，对系统适用参数进行考察，没食子酸理论板数为6893。理论板数大于2000[1]。
2.4线性关系考察分别精密吸取2.2.1项下的没食子酸对照品使用液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0mL，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度;摇匀，即得系列质量浓度的对照品溶液。在2.1项下的色谱条件下测定。以没食子酸浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，经线性回归，回归方程为Y=17.0217X-3.6469，r=1.0000。结果表明：没食子酸在0.9316～46.58μg/mL范围内具有良好的线性关系。对照品、供试品、阴性对照的色谱图见图1。 2.5精密度试验取同一浓度的对照品溶液，在2.1項色谱条件下连续进样测定6次，记录没食子酸峰面积，其RSD为0.8%（n=6）。
2.6稳定性试验取同一在2.2.2项下制备的样品，在2.1项下色谱条件下分别于2、4、8、16、24h进样5μL，记录峰面积，结果测得没食子酸峰面积RSD为0.8%。表明样品在24h稳定。
2.7重复性试验取同一批号样品（批号：2576004），按照2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，在2.1项色谱条件下测定，测得没食子酸含有量RSD为1.2%（n=6）。
2.8加样回收率试验精密称取含有量已知的鳖甲消痔胶囊（批号2576004）6份，每份约0.4g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入浓度为0.4209mg/mL的没食子酸对照品溶液2.5mL，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，计算回收率，结果见表1。
2.9样品测定结果取鳖甲消痔胶囊20粒，精密称定，混匀，取约0.8g，精密称定，平行3份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下测定，计算含有量，结果见表2。
3讨论
3.1检测波长的选择取没食子酸对照品溶液在200～400nm范围内进行紫外扫描，没食子酸在272nm处有最大吸收，与中国药典地榆含量测定项下选用波长一致，故选择272nm为检测波长。
3.2流动相的选择首先尝试了甲醇和水做流动相，经进样检测，结果峰型不好，然后参考中国药典[1]地榆含量项下流动相甲醇-0.05%磷酸溶液（5∶95），发现峰型变好，但目标峰与相邻的杂峰分离不是很好，而且杂峰较多，查阅相关文献[11-13]，改变磷酸溶液浓度为0.025%，发现峰型变好，分离度符合要求，故选择0.025%磷酸-甲醇（4.5∶95.5）作为流动相。
3.3提取方式的选择通过参考中国药典[1]和文献[14-15]，尝试用水和不同浓度（30%、50%、70%）的乙醇作为提取溶剂，煮沸和回流两种提取方式，提取时间（10min、20min、30min、40min）。结果用水做溶剂通过煮沸含量较高，三种不同浓度乙醇回流含量无明显差异且比水煮沸含量低。提取时间20min、30min、40min含量无明显变化。但同时发现以上几种提取出的供试品中目标峰型较差，而且杂峰多，查阅相关文献[16-17]了解到PH对没食子酸稳定性影响较大，没食子酸在酸性条件下稳定，随PH值增加稳定性逐渐下降，碱性条件下极不稳定。尝试加入不同浓度（2%、5%、10%、15%）的盐酸溶液。盐酸溶液加入体积有5、10mL两种。结果发现加入10%盐酸溶液10mL，没食子酸含量测定值最高且与加入15%盐酸溶液10mL无明显差异。综合以上实验，确定了本法的提取方式。
参考文献
[1]孙芳.鳖甲消痔胶囊质量标准研究[J].湖南中医药大学学报，2007，8（27）：239-240.
[2]童红，杨永东，王海宁.HPLC测定鳖甲消痔胶囊中盐酸小檗碱的含量[J].贵阳中医学院学报，2001，6（23）：63-64.
[3]吴开云.冰片、虎杖、地榆抑菌作用的实验研究[J].江西医学院学报，1996，36（3）：53-55.
[4]周本宏，松长青，姜珊，等.地榆鞣质提取物的抗菌活性及对金黄色葡萄球菌的抑菌机制研究[J].中国药师，2016，19（3）：464-469.
[5]程东亮，曹小平，邹佩秀，等.中药地榆黄酮等成分的分离和鉴定[J].中草药，1995，261（11）：570-571.
[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：126.
[7]KoideT，NoseM，InoueM，etal.Trypanocidaleffectsofgallicacidandrelatedcompands[J].Plantamed，1998，64（1）：27-30.
[8]LocatecliC，RossoR，MariaC，eral.EsterderivativesofgallicacidwithpotentialtoxicitytowardL1210leukemiacells[J].BioorganicandwithPotentialMedicinalchemistry，2008，16（1）：3791-3799.
[9]高伦江.余甘子抑菌活性及防腐应用活性研究[D].重庆：西南大学，2008.
[10]刘延麟.没食子酸单体化合物分离鉴定及药理活性研究[D].长春：吉林大学，2008.
[11]刘利军，李瑞莲.反相高效液相色谱法测定地榆药材中没食子酸的含量[J].中国药师，2009，12（7）：797-980.
[12]沙明，曹爱民，王冰，等.高效液相色谱法测定地榆没食子酸的含量[J].国药杂志，1999，24（2）：99-100.
[13]刘志贤.高效液相色谱法测定地榆中没食子酸的含量[J].临床经验与体会，2004，21（2）：164.
[14]蓝海，李龙星，肖培云.紫地榆中没食子酸的提取工艺研究[J].中成药，2009，31（9）：1456-1457.
[15]常连举，张宗和，黄嘉玲，等.没食子酸的制备与应用综述[J].生物质化学工程，2010，44（4）：48-51.
[16]王广娟.五倍子没食子酸的提取、纯化及抑菌效果研究[D].保定：河北农业大学，2010.
[17]瞿燕.五倍子发酵工艺及药理实验研究[D].成都：成都中医药大学，2002.
（收稿日期：2018-07-13编辑：刘斌）