论文部分内容阅读
【中图分类号】R378.11 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2014）06-3532-01
金黄色葡萄球菌是造成人类食物中毒的常见致病菌。近年来，我国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件在全国已占据第四位。金葡肠毒素是金黄色葡萄球菌食物中毒的主要因子，它是一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，共有肠毒素A-E、G-R共17个血清型。据报道，摄入1ug/kg的金葡肠毒素即能引起呕吐和腹泻等症状，严重者可致昏迷有生命危险[1]。《葡萄球菌食物中毒的诊断标准、判定原则和处理原则（WS/T 80-1996）》中规定“从中毒食品、患者吐泻物中经培养检出金黄色葡萄球菌，菌株经肠毒素检测证实在不同样品中检出同一型别肠毒素。”才能判断是由此食物引起的食物中毒。因此，准确、快速的检测金葡肠毒素能为因金黄色葡萄球菌引起的食品安全事故处理提供重要依据。现就金黄色葡萄球菌肠毒素的检测方法研究进展作一综述。
1动物实验
生物学试验是较早采用的一种金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法。通常采用染毒食品或分离的产肠毒素的菌株培养液喂饲敏感动物，或用腹腔注射及皮肤试验，然后观察动物可能出现的各种异常的生理或形态变化，这是测定食物中肠毒素较早采用的一种方法。由于试验动物对肠毒素不敏感或感应性差，无特异性，且易产生假阳性，实用价值低，目前基本不采用。
2放射免疫法（RIA）
经典放射免疫分析是采用标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）竞争性结合定量抗体（Ab）的方法。Ag*和Ag结合抗体的能力相同，可形成Ag*Ab复合物和Ag Ab复合物。当Ag*定量同时限制抗体浓度。且Ag*和Ag的量大于抗体的结合数目时，Ag*和Ag通过竞争方式与抗体结合。随着非标记抗原的增加标记抗原与抗体的结合机会减少，形成Ag* Ab复合物减少，从而放射量也降低。RIA法将同位素测定的高灵敏性和抗原抗体反应的高度特异性有效结合起来，特异性强，敏感性高，检测样品中各型SE可达1ng/mL。[2]。但该方法存在放射性污染和需要专门的防护设备、检测仪器等问题，也不易推广。
3酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA方法基本原理是将抗原或抗体结合到某种固相载体表面，检测时将样品和酶标抗原或抗体與结合在固相载体上的抗原或抗体结合形成复合物，反应终止，结合在固相载体上的酶标抗原或抗体量与标本中待测抗原或抗体量相关，经洗涤除去未结合物，然后加入底物显色，结合物中的酶水解底物，生成有色的反应物，根据颜色的深浅，进行检测，即可确定被测物含量。目前较常用的有微孔板法（ELISA）和酶联荧光免疫法（EIFA）。
3.1酶联荧光免疫法（EIFA），其原理是将鼠抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体SEA-E同时包被在固相容器（SPR）上，通过样品在SPR内定时循环，样品中的肠毒素与多个抗体结合，未结合的样品则被洗去。抗体-碱性磷酸酶复合物通过SPR循环并与SPR壁上的相应肠毒素抗原结合，最后洗去未结合复合物。荧光底物在SPR内外反复循环，SPR上存留的酶催化底物分解为荧光底物。本法可采用自动化VIDAS设备的光扫描仪在450nm处自动测定荧光强度。[3]
3.1微孔板法（ELISA）与酶联荧光免疫法（EIFA）的检测原理相似，均为双抗体夹心法。不同之处在于，微孔法所用的酶底物是显色酶底物而非荧光酶底物，实验结果是通过颜色变化来判断。
4聚合酶链反应（PCR）技术
聚合酶链反应（PCR）技术是通过DNA聚合酶扩增基因为检测特异基因片断提供了可能性。PCR模拟DNA的自然复制过程，引物与DNA模板互补结合以后，在DNA聚合酶的作用下，按照碱基配对的原则，从引物开始合成与模板DNA互补的DNA链。经变性、退火，延伸等一次循环，DNA链数量增加一倍。目前较为常用的有定性PCR和荧光定量PCR法两种。荧光PCR技术在普通PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累检测整个PCR反应的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量。[4]
总之，动物实验方法由于灵敏度低，结果不准确，已经逐渐不为采用。目前，金葡肠毒素的检测方法主要有微孔析法（ELISA）、酶联荧光免疫法（ELFA）、PCR法和荧光PCR法。前两种方法的检测对象是金葡菌产生的肠毒素蛋白质，后两种方法则是检测菌株的肠毒素基因。ELFA法具有灵敏度高，对样品中金葡菌被热处理破坏时，对热稳定的肠毒素仍能检出。荧光PCR法的优势在于可以分型、试剂便宜、操作简单、无需专用仪器。在检测工作中，可以根据各自的仪器设备条件以及相应技术选择适当的检测方法。
参考文献
[1][3][4]王冰，黎桂莲，陈妙玲，等.3种金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的评估[J].中国卫生检验杂志，2013，23（2）：359-362.
[2]梁毅珊.金黄色葡萄球菌肠毒素及其检测方法的研究进展[J].中国热带医学，2008，8（9）：1658-1659.
金黄色葡萄球菌是造成人类食物中毒的常见致病菌。近年来，我国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件在全国已占据第四位。金葡肠毒素是金黄色葡萄球菌食物中毒的主要因子，它是一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，共有肠毒素A-E、G-R共17个血清型。据报道，摄入1ug/kg的金葡肠毒素即能引起呕吐和腹泻等症状，严重者可致昏迷有生命危险[1]。《葡萄球菌食物中毒的诊断标准、判定原则和处理原则（WS/T 80-1996）》中规定“从中毒食品、患者吐泻物中经培养检出金黄色葡萄球菌，菌株经肠毒素检测证实在不同样品中检出同一型别肠毒素。”才能判断是由此食物引起的食物中毒。因此，准确、快速的检测金葡肠毒素能为因金黄色葡萄球菌引起的食品安全事故处理提供重要依据。现就金黄色葡萄球菌肠毒素的检测方法研究进展作一综述。
1动物实验
生物学试验是较早采用的一种金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法。通常采用染毒食品或分离的产肠毒素的菌株培养液喂饲敏感动物，或用腹腔注射及皮肤试验，然后观察动物可能出现的各种异常的生理或形态变化，这是测定食物中肠毒素较早采用的一种方法。由于试验动物对肠毒素不敏感或感应性差，无特异性，且易产生假阳性，实用价值低，目前基本不采用。
2放射免疫法（RIA）
经典放射免疫分析是采用标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）竞争性结合定量抗体（Ab）的方法。Ag*和Ag结合抗体的能力相同，可形成Ag*Ab复合物和Ag Ab复合物。当Ag*定量同时限制抗体浓度。且Ag*和Ag的量大于抗体的结合数目时，Ag*和Ag通过竞争方式与抗体结合。随着非标记抗原的增加标记抗原与抗体的结合机会减少，形成Ag* Ab复合物减少，从而放射量也降低。RIA法将同位素测定的高灵敏性和抗原抗体反应的高度特异性有效结合起来，特异性强，敏感性高，检测样品中各型SE可达1ng/mL。[2]。但该方法存在放射性污染和需要专门的防护设备、检测仪器等问题，也不易推广。
3酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA方法基本原理是将抗原或抗体结合到某种固相载体表面，检测时将样品和酶标抗原或抗体與结合在固相载体上的抗原或抗体结合形成复合物，反应终止，结合在固相载体上的酶标抗原或抗体量与标本中待测抗原或抗体量相关，经洗涤除去未结合物，然后加入底物显色，结合物中的酶水解底物，生成有色的反应物，根据颜色的深浅，进行检测，即可确定被测物含量。目前较常用的有微孔板法（ELISA）和酶联荧光免疫法（EIFA）。
3.1酶联荧光免疫法（EIFA），其原理是将鼠抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体SEA-E同时包被在固相容器（SPR）上，通过样品在SPR内定时循环，样品中的肠毒素与多个抗体结合，未结合的样品则被洗去。抗体-碱性磷酸酶复合物通过SPR循环并与SPR壁上的相应肠毒素抗原结合，最后洗去未结合复合物。荧光底物在SPR内外反复循环，SPR上存留的酶催化底物分解为荧光底物。本法可采用自动化VIDAS设备的光扫描仪在450nm处自动测定荧光强度。[3]
3.1微孔板法（ELISA）与酶联荧光免疫法（EIFA）的检测原理相似，均为双抗体夹心法。不同之处在于，微孔法所用的酶底物是显色酶底物而非荧光酶底物，实验结果是通过颜色变化来判断。
4聚合酶链反应（PCR）技术
聚合酶链反应（PCR）技术是通过DNA聚合酶扩增基因为检测特异基因片断提供了可能性。PCR模拟DNA的自然复制过程，引物与DNA模板互补结合以后，在DNA聚合酶的作用下，按照碱基配对的原则，从引物开始合成与模板DNA互补的DNA链。经变性、退火，延伸等一次循环，DNA链数量增加一倍。目前较为常用的有定性PCR和荧光定量PCR法两种。荧光PCR技术在普通PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累检测整个PCR反应的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量。[4]
总之，动物实验方法由于灵敏度低，结果不准确，已经逐渐不为采用。目前，金葡肠毒素的检测方法主要有微孔析法（ELISA）、酶联荧光免疫法（ELFA）、PCR法和荧光PCR法。前两种方法的检测对象是金葡菌产生的肠毒素蛋白质，后两种方法则是检测菌株的肠毒素基因。ELFA法具有灵敏度高，对样品中金葡菌被热处理破坏时，对热稳定的肠毒素仍能检出。荧光PCR法的优势在于可以分型、试剂便宜、操作简单、无需专用仪器。在检测工作中，可以根据各自的仪器设备条件以及相应技术选择适当的检测方法。
参考文献
[1][3][4]王冰，黎桂莲，陈妙玲，等.3种金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的评估[J].中国卫生检验杂志，2013，23（2）：359-362.
[2]梁毅珊.金黄色葡萄球菌肠毒素及其检测方法的研究进展[J].中国热带医学，2008，8（9）：1658-1659.