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摘 要 目的：研究大肠腺癌、大肠腺瘤和癌旁正常组织中Raf-1蛋白激酶和VEGF的表达及其临床意义。方法：收集72例大肠腺癌患者的手术切除标本共112份，其中取自癌组织72份，癌旁正常组织40份，收集40例大肠腺瘤患者的肠镜下切除标本，采用免疫组化法检测其Raf-1蛋白激酶及VEGF的表达。结果：72例大肠腺癌组织中，Raf-1蛋白激酶的阳性表达率为29.17%，VEGF的阳性表达率为41.67%，40例大肠腺瘤组织中，Raf-1蛋白激酶阳性表达率为12.50%，VEGF阳性表达率为22.50%，40例癌旁正常组织中，Raf-1蛋白激酶阳性表达率为2.50%，VEGF阳性表达率为10.00%，大肠腺癌Raf-1蛋白激酶及VEGF的阳性表达率均显著高于大肠腺瘤组织和癌旁正常组织(P<0.05)；大肠腺癌中Raf-1蛋白激酶的表达与患者的年龄、性别、病灶大小、分化程度、有无淋巴结转移、病灶浸润深度及Dukes分期均无关(P>0.05)；大肠腺癌中VEGF的表达与患者的年龄、性别、病灶大小、分化程度均无关(P>0.05)，但与肿瘤有无淋巴结转移、病灶浸润深度及Dukes分期均密切相关(P<0.05)。结论：Raf-1蛋白激酶及VEGF对大肠腺癌的发生、发展具有一定的促进作用，但Raf-1蛋白激酶在判断大肠腺癌浸润转移方面的意义尚不肯定。VEGF 与大肠腺癌的血管生成密切相关，对大肠腺癌的生长和浸润转移具有肯定的促进作用。
关键词 Raf-1蛋白激酶 VEGF 大肠腺癌 大肠腺瘤
中图分类号：R57
文献标识码：B
文章编号：1006-1533(2009)02-0073-03
大肠癌是胃肠道常见恶性肿瘤，半数以上来自腺瘤癌变，从形态学上可见到细胞增生、腺瘤形成及癌变各阶段相应的染色体改变，现已证实其发生、发展是一个多步骤、多阶段及多基因参与的异质性疾病[1]。本研究采用免疫组化方法，检测并初步分析Raf-1蛋白激酶及VEGF在大肠腺癌、癌旁正常组织、大肠腺瘤中的表达及其临床意义，以探讨Raf-1蛋白激酶及VEGF的表达在大肠腺癌发生、发展中的作用及与大肠腺癌临床病理特征的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集无锡第四人民医院2006年1月1日至12月31日肿瘤外科住院患者行手术治疗的72例大肠腺癌患者的切除标本共112份，其中癌组织72份，非癌肠组织40份(距癌肿边缘5 cm以外取材)，其中男性46例，女性26例，年龄36~70岁。参照1990年世界卫生组织推荐的分化分级标准，低分化腺癌32例，中、高分化腺癌40例；有淋巴结转移29例，无淋巴结转移43例；并根据患者临床资料及病理资料判断术后Dukes分期：A期19例，B期24例，C期24例，D期5例。所有病例术前均未进行放疗及化疗。另收集同期无锡第四人民医院消化内镜室对住院及门诊患者进行肠镜下大肠息肉样病灶高频电切除术所得标本且经病理诊断明确为腺瘤者40例，其中男性24例，女性16例，年龄31~68岁。
1.2 免疫组化检测
鼠抗人VEGF单克隆抗体工作液(JH121)购自福州迈新生物技术开发有限公司。鼠抗人Raf-1单克隆抗体浓缩液(PS338[DPR/2/2A/3A])购自Lab Vision公司。实验步骤按试剂盒说明书进行。
1.3 阳性结果判定
免疫组化染色阳性信号呈棕黄或棕褐色。Raf-1蛋白激酶表达按所购试剂说明书要求以人扁桃体组织切片为阳性对照片，显微镜下观察肿瘤细胞胞核出现棕黄色颗粒为阳性，阴性对照用磷酸盐缓冲液替代第一抗体所得组织切片表现为标准。VEGF以细胞膜或胞浆内有棕黄色颗粒为阳性，高倍镜下(400倍)对每张切片随机选择5个视野，计数200个细胞/视野，共计1 000个，阳性细胞率≤10%计为阴性表达，阳性细胞率>10%为阳性表达。
1.4 统计学处理
实验数据应用SPSS 10.0统计软件包进行分析，不同组织间Raf-1蛋白激酶和VEGF表达差异及Raf-1蛋白激酶和VEGF表达与大肠癌临床病理参数间关系采用卡方检验及Fisher精确概率法。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大肠腺癌、大肠腺瘤及癌旁正常组织中的Raf-1蛋白激酶和VEGF表达
72例大肠腺癌组织中，Raf-1蛋白激酶阳性表达率为29.17%(21/72)，VEGF阳性表达率为41.67%(30/72)，40例大肠腺瘤组织中，Raf-1蛋白激酶阳性表达率为12.50%(5/40)，VEGF阳性表达率为22.50%(9/40)。40例癌旁正常组织中，Raf-1蛋白激酶阳性表达率为2.50%(1/40)，VEGF阳性表达率为10.00%(4/40)。大肠腺癌与大肠腺瘤、大肠腺癌与癌旁正常组织中的Raf-1蛋白激酶和VEGF的阳性表达率比较均有统计学差异(P<0.05)。大肠腺瘤与癌旁正常组织中的Raf-1蛋白激酶和VEGF的阳性表达无统计学差异(P>0.05)。
2.2 Raf-1蛋白激酶和VEGF表达与大肠腺癌不同临床病理参数的关系
Raf-1蛋白激酶在大肠腺癌中表达与患者的年龄、性别、病灶大小、分化程度、有无淋巴结转移、病灶浸润深度是否突破浆膜层及Dukes分期(比较A+B期和C+D期)均无统计学差异(P>0.05)；VEGF在大肠腺癌中表达与患者的年龄、性别、病灶大小、分化程度均无统计学差异(P>0.05)，但与大肠腺癌病灶有无淋巴结转移、病灶浸润深度是否突破浆膜层及Dukes分期(比较A+B期和C+D期)均有显著性差异(P<0.05)。见表1。
3 讨论
大肠癌的组织发生有以下两种方式：1)从腺瘤演变为癌，即腺瘤-癌顺序。2)从正常黏膜或炎症黏膜发展为癌，即de novo癌。近年来大量的流行病学、病理学和遗传学等研究也均支持大肠腺瘤是大肠癌的主要癌前状态的观点，目前认为，80%以上的大肠癌系由大肠腺瘤演变而来[2]。因此，腺瘤恶变在大肠癌的发生中有重要意义。在大肠腺瘤恶变的过程中，RAS基因、APC基因、DCC基因、MCC基因和P53基因的突变起较关键的作用，而Raf蛋白激酶作为RAS基因的下游效应分子，通过MAPKs途径，在大肠腺瘤癌变的过程中起了重要的促进作用。
Sun Y等 [3]研究认为，在大肠癌形成过程中，Raf-1蛋白激酶表达增高，MAPKs通路持续激活，抑制了大肠癌SW480和Colo-205细胞的P21WAF1和P27KIP1等抑癌基因的表达，并促进细胞周期由G1/G0到S期(DNA合成期)转化，导致未修复的受损基因和癌基因大量合成、聚集，刺激肠黏膜细胞异型增生而导致大肠腺瘤和大肠癌形成。
在本研究中，大肠腺癌及大肠腺瘤组织中Raf-1蛋白激酶的表达均高于癌旁正常组织，且大肠腺癌组织中Raf-1蛋白激酶的表达明显高于大肠腺瘤组织，提示其高活性表达可能与刺激肠黏膜上皮腺瘤形成，并最终导致腺瘤恶变有关。但研究提示，Raf-1蛋白激酶在大肠腺癌组织中的表达与Dukes 分期、病灶浸润深度及淋巴结转移关系不大。
VEGF在体内有诱导血管生长、内皮细胞增殖、迁移、增强血管通透性的作用。在肿瘤形成过程中，VEGF直接作用于血管内皮细胞膜上的Ⅲ型酪氨酸激酶受体，能增加微血管特别是毛细血管和小静脉的通透性，促进血浆纤维素外渗，为血管形成过程中的细胞迁移提供一个纤维网络，从而有利于肿瘤细胞的微转移[4]。纤维蛋白原和血浆纤维连接蛋白在肿瘤间质中积聚，高度特异地选择性诱导血管内皮细胞有丝分裂，刺激内皮细胞增殖，诱发组织因子、胶原酶产生，从而诱发新生血管形成和肿瘤生长[5，6]。丰富的新生血管形成不仅增加了肿瘤细胞进入血液循环的机会，而且肿瘤细胞还可以侵入与毛细血管伴行的邻近淋巴管，或通过淋巴静脉连接进入淋巴管，促进淋巴转移。VEGF与淋巴内皮细胞上的受体Fit-4结合后，可通过MEK/ERK和PI3-激酶/Akt途径引起发育中的淋巴管内皮细胞增生、迁移及抑制内皮细胞凋亡，从而发挥促淋巴管新生的作用[7，8]。
本研究发现，VEGF在大肠腺癌及大肠腺瘤组织中的表达均较癌旁正常组织明显增高，且在大肠腺癌组织中VEGF表达明显高于大肠腺瘤组织，VEGF的表达与大肠腺癌Dukes分期、淋巴结转移、病灶浸润深度密切相关，与刘强等[9～11]近年来报道的大肠癌组织中VEGF的表达情况一致。研究表明，VEGF 与新生血管形成有关，通过促进新生血管形成而促进大肠癌的生长和浸润、转移，VEGF 可成为反映大肠癌生物学行为的客观指标。
参考文献
1 钱礼.钱礼腹部外科学[M].第一版.北京：人民卫生出版社，2006：480-482.
2 项平.大肠肿瘤基础与临床进展[M].第一版.上海：上海科学技术出版社，2007：31-32.
3 SunY，Sinicrope FA. Selective inhibitors of MEK1/ERK44/42 and P38 mitogen-activated protein kinases potentiate apoptosis induction by sulindac sulfide in human colon carcinoma cells[J]. Mol Cancer Ther，2005，4(1)：51-59.
4 Katoh Y，Katoh M. Comparative integromics on VEGF family members[J].Int J Oncol，2006，28(6)：1585-1589.
5 Jung YD，Kim MS，Shin BA，et al.EGCG，a major component of green tea，inhibits tumour growth by inhibiting VEGF induction in human colon carcinoma cells[J].Br J Cancer，2001，84(6)：844-850.
6 Witte D，Thomas A，Ali N，et al. Expression of the vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3) and its ligand VEGF-C in human colorectal adenocarcinoma[J].Anticancer Res，2002，22(3)：1463-1466.
7 Su JL，Yang PC，Shih JY，et al. The VEGF-C/Flt-4 axis promotes invasion and metastasis of cancer cells[J].Cancer Cell，2006，9(3)：209-213.
8 Zeng Y，Opeskin K，Baldwin ME，et al. Expression of vascular endothelial growth factor receptor-3 by lymphatic endothelial cells is associated with lymph node metastasis in prostate cancer[J].Clin Cancer Res，2004，10(8)：5137-5144.
9 刘强，陈卫昌，傅建新，等.大肠癌组织中血管生成与凋亡、增殖的关系[J].中华消化杂志，2004，24(7)：418-421.
10 郑丰平，袁世珍，王俊雅，等. P53、血管内皮生长因子蛋白表达与结肠癌血管生成的关系[J].中华消化杂志，2001，21(12)：749-750.
11 雷雯，周锡庚，郁宝铭，等.血管内皮生长因子和血管生成与大肠癌发展的关系[J].中华消化杂志，2001，21(8)：455-457.
(收稿日期：2008-10-24)
关键词 Raf-1蛋白激酶 VEGF 大肠腺癌 大肠腺瘤
中图分类号：R57
文献标识码：B
文章编号：1006-1533(2009)02-0073-03
大肠癌是胃肠道常见恶性肿瘤，半数以上来自腺瘤癌变，从形态学上可见到细胞增生、腺瘤形成及癌变各阶段相应的染色体改变，现已证实其发生、发展是一个多步骤、多阶段及多基因参与的异质性疾病[1]。本研究采用免疫组化方法，检测并初步分析Raf-1蛋白激酶及VEGF在大肠腺癌、癌旁正常组织、大肠腺瘤中的表达及其临床意义，以探讨Raf-1蛋白激酶及VEGF的表达在大肠腺癌发生、发展中的作用及与大肠腺癌临床病理特征的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集无锡第四人民医院2006年1月1日至12月31日肿瘤外科住院患者行手术治疗的72例大肠腺癌患者的切除标本共112份，其中癌组织72份，非癌肠组织40份(距癌肿边缘5 cm以外取材)，其中男性46例，女性26例，年龄36~70岁。参照1990年世界卫生组织推荐的分化分级标准，低分化腺癌32例，中、高分化腺癌40例；有淋巴结转移29例，无淋巴结转移43例；并根据患者临床资料及病理资料判断术后Dukes分期：A期19例，B期24例，C期24例，D期5例。所有病例术前均未进行放疗及化疗。另收集同期无锡第四人民医院消化内镜室对住院及门诊患者进行肠镜下大肠息肉样病灶高频电切除术所得标本且经病理诊断明确为腺瘤者40例，其中男性24例，女性16例，年龄31~68岁。
1.2 免疫组化检测
鼠抗人VEGF单克隆抗体工作液(JH121)购自福州迈新生物技术开发有限公司。鼠抗人Raf-1单克隆抗体浓缩液(PS338[DPR/2/2A/3A])购自Lab Vision公司。实验步骤按试剂盒说明书进行。
1.3 阳性结果判定
免疫组化染色阳性信号呈棕黄或棕褐色。Raf-1蛋白激酶表达按所购试剂说明书要求以人扁桃体组织切片为阳性对照片，显微镜下观察肿瘤细胞胞核出现棕黄色颗粒为阳性，阴性对照用磷酸盐缓冲液替代第一抗体所得组织切片表现为标准。VEGF以细胞膜或胞浆内有棕黄色颗粒为阳性，高倍镜下(400倍)对每张切片随机选择5个视野，计数200个细胞/视野，共计1 000个，阳性细胞率≤10%计为阴性表达，阳性细胞率>10%为阳性表达。
1.4 统计学处理
实验数据应用SPSS 10.0统计软件包进行分析，不同组织间Raf-1蛋白激酶和VEGF表达差异及Raf-1蛋白激酶和VEGF表达与大肠癌临床病理参数间关系采用卡方检验及Fisher精确概率法。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大肠腺癌、大肠腺瘤及癌旁正常组织中的Raf-1蛋白激酶和VEGF表达
72例大肠腺癌组织中，Raf-1蛋白激酶阳性表达率为29.17%(21/72)，VEGF阳性表达率为41.67%(30/72)，40例大肠腺瘤组织中，Raf-1蛋白激酶阳性表达率为12.50%(5/40)，VEGF阳性表达率为22.50%(9/40)。40例癌旁正常组织中，Raf-1蛋白激酶阳性表达率为2.50%(1/40)，VEGF阳性表达率为10.00%(4/40)。大肠腺癌与大肠腺瘤、大肠腺癌与癌旁正常组织中的Raf-1蛋白激酶和VEGF的阳性表达率比较均有统计学差异(P<0.05)。大肠腺瘤与癌旁正常组织中的Raf-1蛋白激酶和VEGF的阳性表达无统计学差异(P>0.05)。
2.2 Raf-1蛋白激酶和VEGF表达与大肠腺癌不同临床病理参数的关系
Raf-1蛋白激酶在大肠腺癌中表达与患者的年龄、性别、病灶大小、分化程度、有无淋巴结转移、病灶浸润深度是否突破浆膜层及Dukes分期(比较A+B期和C+D期)均无统计学差异(P>0.05)；VEGF在大肠腺癌中表达与患者的年龄、性别、病灶大小、分化程度均无统计学差异(P>0.05)，但与大肠腺癌病灶有无淋巴结转移、病灶浸润深度是否突破浆膜层及Dukes分期(比较A+B期和C+D期)均有显著性差异(P<0.05)。见表1。
3 讨论
大肠癌的组织发生有以下两种方式：1)从腺瘤演变为癌，即腺瘤-癌顺序。2)从正常黏膜或炎症黏膜发展为癌，即de novo癌。近年来大量的流行病学、病理学和遗传学等研究也均支持大肠腺瘤是大肠癌的主要癌前状态的观点，目前认为，80%以上的大肠癌系由大肠腺瘤演变而来[2]。因此，腺瘤恶变在大肠癌的发生中有重要意义。在大肠腺瘤恶变的过程中，RAS基因、APC基因、DCC基因、MCC基因和P53基因的突变起较关键的作用，而Raf蛋白激酶作为RAS基因的下游效应分子，通过MAPKs途径，在大肠腺瘤癌变的过程中起了重要的促进作用。
Sun Y等 [3]研究认为，在大肠癌形成过程中，Raf-1蛋白激酶表达增高，MAPKs通路持续激活，抑制了大肠癌SW480和Colo-205细胞的P21WAF1和P27KIP1等抑癌基因的表达，并促进细胞周期由G1/G0到S期(DNA合成期)转化，导致未修复的受损基因和癌基因大量合成、聚集，刺激肠黏膜细胞异型增生而导致大肠腺瘤和大肠癌形成。
在本研究中，大肠腺癌及大肠腺瘤组织中Raf-1蛋白激酶的表达均高于癌旁正常组织，且大肠腺癌组织中Raf-1蛋白激酶的表达明显高于大肠腺瘤组织，提示其高活性表达可能与刺激肠黏膜上皮腺瘤形成，并最终导致腺瘤恶变有关。但研究提示，Raf-1蛋白激酶在大肠腺癌组织中的表达与Dukes 分期、病灶浸润深度及淋巴结转移关系不大。
VEGF在体内有诱导血管生长、内皮细胞增殖、迁移、增强血管通透性的作用。在肿瘤形成过程中，VEGF直接作用于血管内皮细胞膜上的Ⅲ型酪氨酸激酶受体，能增加微血管特别是毛细血管和小静脉的通透性，促进血浆纤维素外渗，为血管形成过程中的细胞迁移提供一个纤维网络，从而有利于肿瘤细胞的微转移[4]。纤维蛋白原和血浆纤维连接蛋白在肿瘤间质中积聚，高度特异地选择性诱导血管内皮细胞有丝分裂，刺激内皮细胞增殖，诱发组织因子、胶原酶产生，从而诱发新生血管形成和肿瘤生长[5，6]。丰富的新生血管形成不仅增加了肿瘤细胞进入血液循环的机会，而且肿瘤细胞还可以侵入与毛细血管伴行的邻近淋巴管，或通过淋巴静脉连接进入淋巴管，促进淋巴转移。VEGF与淋巴内皮细胞上的受体Fit-4结合后，可通过MEK/ERK和PI3-激酶/Akt途径引起发育中的淋巴管内皮细胞增生、迁移及抑制内皮细胞凋亡，从而发挥促淋巴管新生的作用[7，8]。
本研究发现，VEGF在大肠腺癌及大肠腺瘤组织中的表达均较癌旁正常组织明显增高，且在大肠腺癌组织中VEGF表达明显高于大肠腺瘤组织，VEGF的表达与大肠腺癌Dukes分期、淋巴结转移、病灶浸润深度密切相关，与刘强等[9～11]近年来报道的大肠癌组织中VEGF的表达情况一致。研究表明，VEGF 与新生血管形成有关，通过促进新生血管形成而促进大肠癌的生长和浸润、转移，VEGF 可成为反映大肠癌生物学行为的客观指标。
参考文献
1 钱礼.钱礼腹部外科学[M].第一版.北京：人民卫生出版社，2006：480-482.
2 项平.大肠肿瘤基础与临床进展[M].第一版.上海：上海科学技术出版社，2007：31-32.
3 SunY，Sinicrope FA. Selective inhibitors of MEK1/ERK44/42 and P38 mitogen-activated protein kinases potentiate apoptosis induction by sulindac sulfide in human colon carcinoma cells[J]. Mol Cancer Ther，2005，4(1)：51-59.
4 Katoh Y，Katoh M. Comparative integromics on VEGF family members[J].Int J Oncol，2006，28(6)：1585-1589.
5 Jung YD，Kim MS，Shin BA，et al.EGCG，a major component of green tea，inhibits tumour growth by inhibiting VEGF induction in human colon carcinoma cells[J].Br J Cancer，2001，84(6)：844-850.
6 Witte D，Thomas A，Ali N，et al. Expression of the vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3) and its ligand VEGF-C in human colorectal adenocarcinoma[J].Anticancer Res，2002，22(3)：1463-1466.
7 Su JL，Yang PC，Shih JY，et al. The VEGF-C/Flt-4 axis promotes invasion and metastasis of cancer cells[J].Cancer Cell，2006，9(3)：209-213.
8 Zeng Y，Opeskin K，Baldwin ME，et al. Expression of vascular endothelial growth factor receptor-3 by lymphatic endothelial cells is associated with lymph node metastasis in prostate cancer[J].Clin Cancer Res，2004，10(8)：5137-5144.
9 刘强，陈卫昌，傅建新，等.大肠癌组织中血管生成与凋亡、增殖的关系[J].中华消化杂志，2004，24(7)：418-421.
10 郑丰平，袁世珍，王俊雅，等. P53、血管内皮生长因子蛋白表达与结肠癌血管生成的关系[J].中华消化杂志，2001，21(12)：749-750.
11 雷雯，周锡庚，郁宝铭，等.血管内皮生长因子和血管生成与大肠癌发展的关系[J].中华消化杂志，2001，21(8)：455-457.
(收稿日期：2008-10-24)