【摘 要】
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本研究采用pET28a载体对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的转肽酶A(sortaseA,SrtA)截短体SrtA△N25以及突变体m5SrtA△N59、m9SrtA△N59进行了原核发酵表达,并通过
【机 构】
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中国医药工业研究总院上海医药工业研究院,创新药物与制药工艺国家重点实验室,上海 201203上海多米瑞生物技术有限公司,上海,201203;中国医药工业研究总院上海医药工业研究院,创新药物与制药工艺国
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本研究采用pET28a载体对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的转肽酶A(sortaseA,SrtA)截短体SrtA△N25以及突变体m5SrtA△N59、m9SrtA△N59进行了原核发酵表达,并通过镍柱亲和色谱、阳离子交换色谱进行蛋白纯化.随后,通过荧光共振能量转移试验比较了3种酶的催化活性,测定了酶反应动力学常数、筛选了最适反应条件,并进一步探究了不同生化试剂对SrtA酶学活性的影响.结果 显示,SrtA△N25、m5SrtA△N59、m9SrtA△N59在大肠埃希菌中均能以可溶形式高效表达,且纯化后得到的高纯度SrtA酶均具有生物学活性.相较于SrtA△N25,m5SrtA△N59、m9SrtA△N59活性分别提高了约68、5 544倍,尤其是m9SrtA△N59的催化活性大大提高.m9SrtA△N59的最适反应温度为30～37℃,最适反应pH值为6.0～7.0,反应体系中加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)等还原剂有助于增强SrtA酶催化活性.
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