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生物柴油通常由植物油和动物脂肪（三甘油酯）经碱催化酯化成为脂肪酸酯类来制取。这一过程需采用预处理步骤以从进料中去除游离脂肪酸，另外，因存在游离脂肪酸使反应速率降低，并因脂肪酸酯与甘油产物相分离困难，致使产率降低。碱催化剂从甘油中去除也困难，同时含碱废水必须从过程中予以处理。虽然已经开发了一些替代路线生产生物柴油，如基于超临界醇或酶的工艺，但需要耐高压／高温设备或需采用高稳定性和活性的酶类，距离工业化尚远。