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摘要：目的 观察针刀疗法对肩周炎兔血清和肌肉组织中5-羟色胺（5-HT）和前列腺素E2（PGE2）含量的影响，探讨针刀疗法对肩周炎干预作用的可能机制及介入时机。方法 将40只雄性新西兰兔随机分为正常组、模型组、针刀A组（疼痛期干预）、针刀B组（僵硬期干预）、针刀C组（疼痛期及僵硬期均干预），每组8只。应用持续劳损加冰敷方法制备肩周炎家兔模型，于实验第33日分别取血清、肱二头肌、冈上肌、冈下肌，检测5-HT和PGE2的含量。结果 模型组血清和肌肉组织中5-HT和PGE2含量均较正常显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；针刀各组较模型组均有不同程度的降低，针刀C组血清和肌肉组织中5-HT和PGE2含量较模型组均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05， P<0.01），优于针刀A组和针刀B组。结论 针刀疗法对肩周炎模型兔血清和肌肉组织中的5-HT和PGE2具有一定的调节作用，疼痛期和僵硬期同时干预效果更佳。
关键词：针刀疗法；肩周炎；五羟色胺；前列腺素E2；病理分期；兔
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.06.014
中图分类号：R245.319 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）06-0038-03
肩周炎以肩部弥漫性疼痛与肩关节活动障碍为主要特征，病变涉及肩关节周围肌肉、肌腱、筋膜、韧带、滑膜囊、关节囊等软组织，是临床常见的慢性退行性病变。临床研究表明，针刀疗法治疗本病有确切的疗效，可显著减轻疼痛，改善肩关节功能活动[1]，但对其机理尚缺乏实验研究。本实验通过观察针刀疗法对肩周炎模型兔血清和肌肉组织中5-羟色胺（5-HT）和前列腺素E2（PGE2）的影响，探讨针刀疗法对肩周炎模型的局部镇痛作用机制及介入时机。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
健康雄性新西兰兔40只，兔龄（6±0.5）个月，体质量（2.5±0.5）kg，北京市海淀区兴隆实验动物养殖场提供，合格证号：SCXK（京）2006-0001，北京中医药大学基础医学院实验动物中心动物室喂养。适应性饲养3 d后，随机分为正常组、模型组、针刀A组（疼痛期干预）、针刀B组（僵硬期干预）、针刀C组（疼痛期及僵硬期均干预），每组8只。
1.2 主要仪器
0.4 mm×40 mm汉章牌Ⅰ型针刀，北京华夏针刀医疗器械厂；5415R高速离心机，德国Eppendorf公司；MDF-U50A超低温冰箱，日本SANYO公司；ZD-9556水平摇床，江苏太仓市实验设备厂；SHZ-88台式水浴恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂；DY89-1型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 主要试剂
75%酒精，北京海德润制药有限公司；碘伏消毒剂，武汉同济美迪生科技有限公司；0.9%氯化钠注射液，四川科伦药业股份有限公司；水合氯醛，北京化学试剂厂；兔5-HT、PGE2 ELISA测定试剂盒，北京尚柏恒通公司。
1.4 造模方法
参照文献[2]方法进行造模。首先用弯剪剪除兔右肩部外侧约6 cm×6 cm的兔毛，然后使兔俯卧，将两后肢和左前肢固定于兔台，右前肢与水平摇床固定连接。以240次/min频率、1.5 cm振幅平行摇动肩关节，每日持续4 h，连续3 d。然后将肩袖袋（自制）以水浸湿后装冰块（每块3 cm×3 cm×1.5 cm，每袋每次装4块）外敷兔右肩部，当冰块融化将尽时更换，每日持续4 h，连续3 d。第1次摇动兔肩关节当日记为实验第1日。根据熊氏等[3]的病理观察结果确定病理分期。正常组造模期间每日固定于兔台4 h，共6 d。
1.5 处理方法
正常组和模型组正常饲养，不做干预处理；针刀A组在实验第9、16日各进行1次针刀干预，共2次；针刀B组在实验第23、30日各进行1次针刀干预，共2次；针刀C组在实验第9、16、23、30日各进行1次针刀干预，共4次。针刀方法：将模型兔固定，对患侧肩部软组织进行触诊，分别在结节间沟、大圆肌起始部、冈上肌腱与肌腹结合部3处寻找到阳性反应点后进针刀，做纵行疏通与横行剥离2～3刀，出针刀后按压1 min，防止出血。期间共4只兔退出实验。
1.6 取材与指标检测
各组动物均于实验第33日进行取材。采用10%水合氯醛按2 mL/kg体质量进行耳缘静脉麻醉，麻醉完全后，腹主动脉取血4 mL，室温下血液自然凝固10～20 min后，冷冻离心机4 ℃、3 000 r/min离心20 min，取上清液，置于-70 ℃冰箱中保存待测；取血后迅速进行肩关节周围软组织取材，分别取肱二头肌、冈上肌、冈下肌相同位置、相同大小的组织块，将组织块置冰面上，0.9%氯化钠注射液漂洗干净，除去血迹，滤纸吸干，称质量，按10%的比例往组织中加入匀浆介质（由pH 7.4、0.01 mol/L Tris-HCl、0.000 1 mol/L EDTA 0.01 mol/L蔗糖、PMSF 0.1 mmol/L、BSA 0.1%组成），用眼科剪于冰水浴中剪碎组织块，然后在冰浴中超声匀浆30 s，之后4 ℃、2 000 r/min离心10 min。取上清液，置于-70 ℃冰箱中保存待测。腹主动脉放血处死动物。血清及肌肉5-HT和PGE2均采用ELISA法进行检测。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。
1.7 统计学方法
采用SAS8.2统计软件进行统计。各组数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，2组间比较用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果（见表1）
3 讨论
在组织炎症或损伤时，损伤的组织向细胞外液中释放一些能引起疼痛的内源性化学物质，如组织胺、5-HT、前列腺素、P物质等。这些致痛物质除能直接兴奋伤害性感受器外，还能提高伤害性感受器的兴奋性，降低其兴奋阈值，使伤害性感受器敏感化。同时还能提高毛细血管通透性，改变其舒缩状态，影响疼痛的产生和发展[4]。 其中5-HT作为一种有很强致痛作用的经典外周致痛递质，低浓度即可致痛，且主要参与血管性疼痛、损伤性疼痛[5]。在外周，5-HT可通过细胞内信号转导的级联机制使伤害性感受器的受体或离子通道磷酸化，使伤害性感受器的感觉阈值降低，参与痛觉过敏的形成[6]。前列腺素中，PGE2的致痛作用强，与慢性软组织损伤的无菌性炎症及疼痛密切相关[7]。它是炎症反应的重要介质，尤其是在慢性炎症中，在炎症局部释放的PGE2可增强感受器的兴奋性，降低神经兴奋阈值，增强其对疼痛刺激的敏感性，造成痛觉过敏[8]；可增强和延长组胺、5-HT、缓激肽等致痛因子对神经末梢的致痛作用；可引起小血管扩张，降低血管张力，增强毛细血管通透性，促进局部炎症性新血管形成[9]；促进白细胞趋化，加重缓激肽和组织胺释放引起水肿，起着介导炎症发生发展的作用[10]。抑制PGE2生成可起到明显的抗炎作用[11]。
肩周炎的病因病理非常复杂，至今尚无定论，目前较为公认的是慢性无菌性炎症学说，其认为肩周炎是肩关节周围软组织的无菌性炎症引发的疼痛和组织粘连，进而出现肩关节的功能障碍[12]。本研究采用持续劳损加冰敷的方法建立肩周炎模型。研究结果显示，模型组血清和局部肌肉组织中5-HT和PGE2的含量较正常明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），提示模型家兔局部产生了较为剧烈的炎症反应和疼痛。
本研究为明确针刀对不同病理分期肩周炎模型的作用机理，根据文献[3]病理分期，选择在疼痛期、僵硬期以及疼痛期和僵硬期对模型实施干预。结果表明，针刀各组对模型家兔血清和肌肉组织中的5-HT和PGE2均具有一定的调节作用，其中在疼痛期和僵硬期均给予针刀干预的针刀C组明显优于疼痛期干预的针刀A组和僵硬期干预的针刀B组，提示针刀干预可降低模型兔血清和肌肉组织中5-HT和PGE2含量，从而减轻肩周炎模型兔局部的炎症反应，减轻其造成的疼痛和痛觉过敏。同时针刀在疼痛期干预也可发挥较好的外周镇痛作用，在疼痛期和僵硬期同时给予针刀干预其外周镇痛效果更佳。本实验结果提示，针刀疗法不仅可以松解粘连，还对外周致痛物质有良性调节作用，起到外周镇痛作用，为针刀早期干预提供了实验依据。
参考文献：
[1] 陈志伍，陈红平.针刀整体松解术后手法治疗肩周炎临床疗效评价[J].针灸临床杂志，2010，26（7）：1-3.
[2] 王晨瑶，方剑乔，邵晓梅，等.肩髃穴电针对肩关节周围炎家兔模型的干预作用[J].浙江中医药大学学报，2007，31（4）：478-480，482.
[3] 熊昌源，毕学薇，刘松林，等.持续机械劳损加冰敷复制实验性兔肩关节周围炎的病理学观察[J].中医药研究，1995，11（5）：52-53.
[4] 钱卫，杜学柯，黄冰，等.布托啡诺术后静脉镇痛对血浆5-羟色胺、P物质和肾上腺素的影响[J].临床麻醉学杂志，2010，26（1）：27-29.
[5] 陈振雨，张维娜，苗嫄昕，等.病理性瘢痕组织中c-fos和5-HT表达及与其增生和痛痒的关系[J].齐鲁医学杂志，2006，21（5）：377-379.
[6] 孙红梅，刘乃刚，李晓泓，等.针刀松解法对第三腰椎横突综合征家兔5-HT和β-EP以及局部组织病理学的影响[J].辽宁中医杂志，2011，38（1）：1-3.
[7] 王涛，苏静，陈文直，等.聚焦超声单次治疗慢性软组织损伤兔局部肌组织前列腺素E2、pH值以及血浆β-内啡肽的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（13）：2451-2454.
[8] Eijkelkamp N， Wang H， Garza-Carbajal A， et al. Low nociceptor GRK2 prolongs prostaglandin E2 hyperalgesia via biased cAMP signaling to Epac/Rap1， protein kinase Cepsilon， and MEK/ERK[J]. J Neurosci，2010，30（38）：12806-12815.
[9] Liclican EL， Nguyen V， Sullivan AB， et al. Selective activation of the prostaglandin E2 circuit in chronic injury-induced pathologic angiogenesis[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci， 2010， 51（12）：6311-6320.
[10] 蒋伟冬，陆金根，曹永清，等.散瘀止痛方熏洗对大鼠炎症足趾PGE2含量及COX-2表达影响的实验研究[J].中华中医药学刊，2011，29（6）：1390-1392.
[11] De Vasconcelos DI， Leite JA， Carneiro LT， et al. Anti- inflammatory and antinociceptive activity of ouabain in mice[J/OL]. Mediators Inflamm. [2011-05-26]. http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/.
[12] De Palma AF. Surgical anatomy of the rotator cuff and the natural history of degenerative periarthritis[J]. Clin Orthop Relat Res，2008，466（3）：543-551.
（收稿日期：2012-01-11，编辑：华强）
关键词：针刀疗法；肩周炎；五羟色胺；前列腺素E2；病理分期；兔
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.06.014
中图分类号：R245.319 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）06-0038-03
肩周炎以肩部弥漫性疼痛与肩关节活动障碍为主要特征，病变涉及肩关节周围肌肉、肌腱、筋膜、韧带、滑膜囊、关节囊等软组织，是临床常见的慢性退行性病变。临床研究表明，针刀疗法治疗本病有确切的疗效，可显著减轻疼痛，改善肩关节功能活动[1]，但对其机理尚缺乏实验研究。本实验通过观察针刀疗法对肩周炎模型兔血清和肌肉组织中5-羟色胺（5-HT）和前列腺素E2（PGE2）的影响，探讨针刀疗法对肩周炎模型的局部镇痛作用机制及介入时机。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
健康雄性新西兰兔40只，兔龄（6±0.5）个月，体质量（2.5±0.5）kg，北京市海淀区兴隆实验动物养殖场提供，合格证号：SCXK（京）2006-0001，北京中医药大学基础医学院实验动物中心动物室喂养。适应性饲养3 d后，随机分为正常组、模型组、针刀A组（疼痛期干预）、针刀B组（僵硬期干预）、针刀C组（疼痛期及僵硬期均干预），每组8只。
1.2 主要仪器
0.4 mm×40 mm汉章牌Ⅰ型针刀，北京华夏针刀医疗器械厂；5415R高速离心机，德国Eppendorf公司；MDF-U50A超低温冰箱，日本SANYO公司；ZD-9556水平摇床，江苏太仓市实验设备厂；SHZ-88台式水浴恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂；DY89-1型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 主要试剂
75%酒精，北京海德润制药有限公司；碘伏消毒剂，武汉同济美迪生科技有限公司；0.9%氯化钠注射液，四川科伦药业股份有限公司；水合氯醛，北京化学试剂厂；兔5-HT、PGE2 ELISA测定试剂盒，北京尚柏恒通公司。
1.4 造模方法
参照文献[2]方法进行造模。首先用弯剪剪除兔右肩部外侧约6 cm×6 cm的兔毛，然后使兔俯卧，将两后肢和左前肢固定于兔台，右前肢与水平摇床固定连接。以240次/min频率、1.5 cm振幅平行摇动肩关节，每日持续4 h，连续3 d。然后将肩袖袋（自制）以水浸湿后装冰块（每块3 cm×3 cm×1.5 cm，每袋每次装4块）外敷兔右肩部，当冰块融化将尽时更换，每日持续4 h，连续3 d。第1次摇动兔肩关节当日记为实验第1日。根据熊氏等[3]的病理观察结果确定病理分期。正常组造模期间每日固定于兔台4 h，共6 d。
1.5 处理方法
正常组和模型组正常饲养，不做干预处理；针刀A组在实验第9、16日各进行1次针刀干预，共2次；针刀B组在实验第23、30日各进行1次针刀干预，共2次；针刀C组在实验第9、16、23、30日各进行1次针刀干预，共4次。针刀方法：将模型兔固定，对患侧肩部软组织进行触诊，分别在结节间沟、大圆肌起始部、冈上肌腱与肌腹结合部3处寻找到阳性反应点后进针刀，做纵行疏通与横行剥离2～3刀，出针刀后按压1 min，防止出血。期间共4只兔退出实验。
1.6 取材与指标检测
各组动物均于实验第33日进行取材。采用10%水合氯醛按2 mL/kg体质量进行耳缘静脉麻醉，麻醉完全后，腹主动脉取血4 mL，室温下血液自然凝固10～20 min后，冷冻离心机4 ℃、3 000 r/min离心20 min，取上清液，置于-70 ℃冰箱中保存待测；取血后迅速进行肩关节周围软组织取材，分别取肱二头肌、冈上肌、冈下肌相同位置、相同大小的组织块，将组织块置冰面上，0.9%氯化钠注射液漂洗干净，除去血迹，滤纸吸干，称质量，按10%的比例往组织中加入匀浆介质（由pH 7.4、0.01 mol/L Tris-HCl、0.000 1 mol/L EDTA 0.01 mol/L蔗糖、PMSF 0.1 mmol/L、BSA 0.1%组成），用眼科剪于冰水浴中剪碎组织块，然后在冰浴中超声匀浆30 s，之后4 ℃、2 000 r/min离心10 min。取上清液，置于-70 ℃冰箱中保存待测。腹主动脉放血处死动物。血清及肌肉5-HT和PGE2均采用ELISA法进行检测。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。
1.7 统计学方法
采用SAS8.2统计软件进行统计。各组数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，2组间比较用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果（见表1）
3 讨论
在组织炎症或损伤时，损伤的组织向细胞外液中释放一些能引起疼痛的内源性化学物质，如组织胺、5-HT、前列腺素、P物质等。这些致痛物质除能直接兴奋伤害性感受器外，还能提高伤害性感受器的兴奋性，降低其兴奋阈值，使伤害性感受器敏感化。同时还能提高毛细血管通透性，改变其舒缩状态，影响疼痛的产生和发展[4]。 其中5-HT作为一种有很强致痛作用的经典外周致痛递质，低浓度即可致痛，且主要参与血管性疼痛、损伤性疼痛[5]。在外周，5-HT可通过细胞内信号转导的级联机制使伤害性感受器的受体或离子通道磷酸化，使伤害性感受器的感觉阈值降低，参与痛觉过敏的形成[6]。前列腺素中，PGE2的致痛作用强，与慢性软组织损伤的无菌性炎症及疼痛密切相关[7]。它是炎症反应的重要介质，尤其是在慢性炎症中，在炎症局部释放的PGE2可增强感受器的兴奋性，降低神经兴奋阈值，增强其对疼痛刺激的敏感性，造成痛觉过敏[8]；可增强和延长组胺、5-HT、缓激肽等致痛因子对神经末梢的致痛作用；可引起小血管扩张，降低血管张力，增强毛细血管通透性，促进局部炎症性新血管形成[9]；促进白细胞趋化，加重缓激肽和组织胺释放引起水肿，起着介导炎症发生发展的作用[10]。抑制PGE2生成可起到明显的抗炎作用[11]。
肩周炎的病因病理非常复杂，至今尚无定论，目前较为公认的是慢性无菌性炎症学说，其认为肩周炎是肩关节周围软组织的无菌性炎症引发的疼痛和组织粘连，进而出现肩关节的功能障碍[12]。本研究采用持续劳损加冰敷的方法建立肩周炎模型。研究结果显示，模型组血清和局部肌肉组织中5-HT和PGE2的含量较正常明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），提示模型家兔局部产生了较为剧烈的炎症反应和疼痛。
本研究为明确针刀对不同病理分期肩周炎模型的作用机理，根据文献[3]病理分期，选择在疼痛期、僵硬期以及疼痛期和僵硬期对模型实施干预。结果表明，针刀各组对模型家兔血清和肌肉组织中的5-HT和PGE2均具有一定的调节作用，其中在疼痛期和僵硬期均给予针刀干预的针刀C组明显优于疼痛期干预的针刀A组和僵硬期干预的针刀B组，提示针刀干预可降低模型兔血清和肌肉组织中5-HT和PGE2含量，从而减轻肩周炎模型兔局部的炎症反应，减轻其造成的疼痛和痛觉过敏。同时针刀在疼痛期干预也可发挥较好的外周镇痛作用，在疼痛期和僵硬期同时给予针刀干预其外周镇痛效果更佳。本实验结果提示，针刀疗法不仅可以松解粘连，还对外周致痛物质有良性调节作用，起到外周镇痛作用，为针刀早期干预提供了实验依据。
参考文献：
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[5] 陈振雨，张维娜，苗嫄昕，等.病理性瘢痕组织中c-fos和5-HT表达及与其增生和痛痒的关系[J].齐鲁医学杂志，2006，21（5）：377-379.
[6] 孙红梅，刘乃刚，李晓泓，等.针刀松解法对第三腰椎横突综合征家兔5-HT和β-EP以及局部组织病理学的影响[J].辽宁中医杂志，2011，38（1）：1-3.
[7] 王涛，苏静，陈文直，等.聚焦超声单次治疗慢性软组织损伤兔局部肌组织前列腺素E2、pH值以及血浆β-内啡肽的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（13）：2451-2454.
[8] Eijkelkamp N， Wang H， Garza-Carbajal A， et al. Low nociceptor GRK2 prolongs prostaglandin E2 hyperalgesia via biased cAMP signaling to Epac/Rap1， protein kinase Cepsilon， and MEK/ERK[J]. J Neurosci，2010，30（38）：12806-12815.
[9] Liclican EL， Nguyen V， Sullivan AB， et al. Selective activation of the prostaglandin E2 circuit in chronic injury-induced pathologic angiogenesis[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci， 2010， 51（12）：6311-6320.
[10] 蒋伟冬，陆金根，曹永清，等.散瘀止痛方熏洗对大鼠炎症足趾PGE2含量及COX-2表达影响的实验研究[J].中华中医药学刊，2011，29（6）：1390-1392.
[11] De Vasconcelos DI， Leite JA， Carneiro LT， et al. Anti- inflammatory and antinociceptive activity of ouabain in mice[J/OL]. Mediators Inflamm. [2011-05-26]. http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/.
[12] De Palma AF. Surgical anatomy of the rotator cuff and the natural history of degenerative periarthritis[J]. Clin Orthop Relat Res，2008，466（3）：543-551.
（收稿日期：2012-01-11，编辑：华强）