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[摘 要]建立从龙胆草中提取龙胆苦苷的工艺参数。方法 龙胆草切割后，用8倍量纯化水提取3次，过滤，浓缩提取液，提取液上大孔树酯柱，用25%乙醇溶液冲洗，浓缩洗脱液，洗脱液加硅胶拌样，干燥后上硅胶柱，用洗脱机洗脱，收集洗脱液，浓缩，分离，得龙胆苦苷样品。结果 所得龙胆苦苷样品纯度大于99%，单一杂质小于0.1%。 结论 所得提取物纯度高，所建立提取方法可行。
[关键词]龙胆苦苷 提取 分离
中图分类号：TM725 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）07-0026-01
龙胆草为龙胆科植物龙胆、条叶龙胆、三花龙胆和滇龙胆、的根和根茎。具有清热、泻肝、定惊之功效。《本草纲目》记载：“性味苦，涩，大寒，无毒。主治骨间寒热、惊病邪气，继绝伤，定五脏，杀虫毒。主要成分为龙胆苦苷，龙胆苦苷无法通过化学合成方法获得，只能中药提取方法获得[1-2]，动物试验研究表明龙胆苦苷能明显促进豚鼠肝组织的修复，对豚鼠同种免疫性肝损伤具有明显的保护作用。龙胆苦苷给药后，胆红素分泌量显著增高，表明具有明显利胆作用。龙胆苦苷药理作用明确[3]，具有广阔的市场价值，本文参照相关文件，建立龙胆草提取方法，从中分离龙胆苦苷。
1.实验材料
提取相关材料：黑龙江地区产2年生龙胆草，切割成5cm左右小段，乙醇及乙酸乙酯均为分析纯，大孔树酯为D101型号，来源为西安蓝晓科技有限公司。
设备：中药提取罐、单效浓缩器、大孔树脂柱、硅胶柱、热风循环干燥箱、球型浓缩器、真空干燥箱。
2.实验方法
2.1 药材前处理
药材应进行净制，去除泥土、杂物，切成5cm的小段，烘干备用。提取之前用纯化水快速冲洗无泥土即可。
2.2 提取工艺路线设计
龙胆苦苷属裂环环烯醚萜苷类成分。它溶于水、乙醇，难溶于极性小的有机溶剂。分别采用水提和乙醇回流提取，为了优选出最佳提取工艺，确定两种基本工艺路线：A水提；B乙醇提取。
2.3 水提取条件研究
正交试验筛选提取方法，对条件进行综合分析后，选定提取水量（A），提取时间（B），提取次数（C）为主要因素，按三因素，三水平设计正交实验，即L9（3）4表来安排试验比较合适。以提取液主成分的百分含量作为评价指标。称取龙胆草9份，每份100g，温度为100℃，按指定要求操作，具体试验安排及结果如下。因素水平见表1。
结果根据方差分析，控制显著因素，找出不显著因素，从而总结出水提最佳工艺为：提取3次，每次10倍水量纯化水，每次时间为30min。
2.4 乙醇提取条件研究
以乙醇为溶媒，选定提取醇浓度（A），提取时间（B），乙醇用量（C），提取次数（D）四因素，按四因素三水平，即L9（3）4设计正交试验，以提取液中龙胆苦苷的百分含量做为工艺评价标准。得出醇提最佳工艺为：提取3次，每次1小时，5倍量醇，醇浓度为45%。
从经济方面考虑，醇提工艺，醇耗大，成本高，且醇提液中混有脂溶性物质，影响产品纯度；而水提工艺，成本低，用时少，只有水溶性成分，降低主成分分离的复杂程度。确定从龙胆草中提取龙胆苦苷以水提工艺为佳。
2.5 提取液分离与纯化
大孔树脂最先用于抗生素的分离，以后在食品工业中广泛应用，现在在中药成分的提取分离中应用日渐增多，它的特点是选择性好，操作简便，可反复使用，利于环保，所以逐渐形成了中药提取的常用技术。龙胆草提取物属于单萜苷类，具有一定的水溶性，它适于大孔树脂的网状结构。实践也证明了D101型大孔树脂对提取物保留性好，容易洗脱，能有效去除原植物中的寡聚及多聚糖类物质，除去无机盐，所以选用了大孔树脂作为主要分离手段。
将提取液使用单效浓缩器进行浓缩，于50～60℃、-0.08Mpa～-0.098Mpa条件下浓缩至0.2kg药材/kg溶液，冷藏备用。
选用D101大孔树酯柱进行分离提取液中主要成分，大孔树酯处理后（酸处理、碱处理、乙醇处理），装柱（高径比大于5），将提取液以1.2L/min～1.5L/min流速通过大孔树脂柱，静止吸附4小时以上。
用纯化水以3.0L/min的流速淋洗树脂柱，用45%乙醇以1.0L/min的流速冲洗大孔树脂柱，收集洗脱液。通过紫外吸收在线监测收集的提取液。
将所得的洗脱液于50℃、-0.098Mpa条件下浓缩至浓稠膏。将浓稠膏如硅胶进行拌样，之后干燥。监测水分，水分应小于1.0%。
将拌样硅胶样上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱液洗脱，分离样品中的有效成分，样品中的主成分为龙胆苦苷，獐芽菜苦苷及獐芽菜苷，通过硅胶柱分离得到目标产物，浓缩目标产物，用乙醇反复洗涤，于真空下减压干燥，得成品，收率为4.5%。经验证，大孔树脂连续使用5次后需再生一次，可连续使用，使用次数约为50次。
2.6 提取物检测
大孔树酯中残留苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯及乙烯苯，照气相色谱法测定原料药中是否含有苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯及乙烯苯，色谱条件：毛细管柱DM-642，30M×0.53mm，结果本品未检出与苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯及乙烯苯。
照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部附录）测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：水 （30：70） 为流动相；检测波长为254nm。理论板数按龙胆苦苷峰计算，应不低于5000。精密称取龙胆苦苷对照品适量，加流动相制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。精密称取本品适量，加流动相制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照上述方法测定提取物含量，结果含量为99.3%。
取本品适量，用乙腈：水 （20：80） 制成每1ml含1mg的溶液作为供试品溶液，精密量取供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，记录色谱至主成分峰保留时间的3倍，使用二极管阵列检测器监测峰纯度，结果龙胆苦苷主成分峰纯度符合规定，已知杂质为獐芽菜苦苷及獐芽菜苷，二者的杂质量均小于0.1%，其它未知杂质均小于0.1%。
3.结论
为确定所建立的工艺条件是否适合于大生产，使用大生产的设备连续生产10批样品，对所确定的提取、浓缩、分离的工艺参数进行系统的评价并进行验证，工艺验证的结果表明投料量在大生产的条件下所确定的工艺参数稳定性好、所得的原料批间质量无差异，各项检验结果无明显差别，表明工艺稳定、可控、重复性好。
参考文献
[1] 李超，韩泳平.响应面优化龙胆草中龙胆苦苷提取工艺的研究. 西南民族大学学报（自然科学版），2013年3月第29卷第3期：205-207.
[2] 崔长旭，柳明洙，李天洙，张学武.龙胆草水提取物对大鼠急性肝损伤的保护作用.延边大学学报，2005年3月第28卷第1期：20-22.
[3] 金香子，徐明.龙胆草提取物抗炎、镇痛、耐缺氧及抗疲劳作用的研究.时针国医国药，2015年16卷第9期：842-843.
作者简介：潘云峰，男，哈药集团中药二厂，质检化验员。
[关键词]龙胆苦苷 提取 分离
中图分类号：TM725 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）07-0026-01
龙胆草为龙胆科植物龙胆、条叶龙胆、三花龙胆和滇龙胆、的根和根茎。具有清热、泻肝、定惊之功效。《本草纲目》记载：“性味苦，涩，大寒，无毒。主治骨间寒热、惊病邪气，继绝伤，定五脏，杀虫毒。主要成分为龙胆苦苷，龙胆苦苷无法通过化学合成方法获得，只能中药提取方法获得[1-2]，动物试验研究表明龙胆苦苷能明显促进豚鼠肝组织的修复，对豚鼠同种免疫性肝损伤具有明显的保护作用。龙胆苦苷给药后，胆红素分泌量显著增高，表明具有明显利胆作用。龙胆苦苷药理作用明确[3]，具有广阔的市场价值，本文参照相关文件，建立龙胆草提取方法，从中分离龙胆苦苷。
1.实验材料
提取相关材料：黑龙江地区产2年生龙胆草，切割成5cm左右小段，乙醇及乙酸乙酯均为分析纯，大孔树酯为D101型号，来源为西安蓝晓科技有限公司。
设备：中药提取罐、单效浓缩器、大孔树脂柱、硅胶柱、热风循环干燥箱、球型浓缩器、真空干燥箱。
2.实验方法
2.1 药材前处理
药材应进行净制，去除泥土、杂物，切成5cm的小段，烘干备用。提取之前用纯化水快速冲洗无泥土即可。
2.2 提取工艺路线设计
龙胆苦苷属裂环环烯醚萜苷类成分。它溶于水、乙醇，难溶于极性小的有机溶剂。分别采用水提和乙醇回流提取，为了优选出最佳提取工艺，确定两种基本工艺路线：A水提；B乙醇提取。
2.3 水提取条件研究
正交试验筛选提取方法，对条件进行综合分析后，选定提取水量（A），提取时间（B），提取次数（C）为主要因素，按三因素，三水平设计正交实验，即L9（3）4表来安排试验比较合适。以提取液主成分的百分含量作为评价指标。称取龙胆草9份，每份100g，温度为100℃，按指定要求操作，具体试验安排及结果如下。因素水平见表1。
结果根据方差分析，控制显著因素，找出不显著因素，从而总结出水提最佳工艺为：提取3次，每次10倍水量纯化水，每次时间为30min。
2.4 乙醇提取条件研究
以乙醇为溶媒，选定提取醇浓度（A），提取时间（B），乙醇用量（C），提取次数（D）四因素，按四因素三水平，即L9（3）4设计正交试验，以提取液中龙胆苦苷的百分含量做为工艺评价标准。得出醇提最佳工艺为：提取3次，每次1小时，5倍量醇，醇浓度为45%。
从经济方面考虑，醇提工艺，醇耗大，成本高，且醇提液中混有脂溶性物质，影响产品纯度；而水提工艺，成本低，用时少，只有水溶性成分，降低主成分分离的复杂程度。确定从龙胆草中提取龙胆苦苷以水提工艺为佳。
2.5 提取液分离与纯化
大孔树脂最先用于抗生素的分离，以后在食品工业中广泛应用，现在在中药成分的提取分离中应用日渐增多，它的特点是选择性好，操作简便，可反复使用，利于环保，所以逐渐形成了中药提取的常用技术。龙胆草提取物属于单萜苷类，具有一定的水溶性，它适于大孔树脂的网状结构。实践也证明了D101型大孔树脂对提取物保留性好，容易洗脱，能有效去除原植物中的寡聚及多聚糖类物质，除去无机盐，所以选用了大孔树脂作为主要分离手段。
将提取液使用单效浓缩器进行浓缩，于50～60℃、-0.08Mpa～-0.098Mpa条件下浓缩至0.2kg药材/kg溶液，冷藏备用。
选用D101大孔树酯柱进行分离提取液中主要成分，大孔树酯处理后（酸处理、碱处理、乙醇处理），装柱（高径比大于5），将提取液以1.2L/min～1.5L/min流速通过大孔树脂柱，静止吸附4小时以上。
用纯化水以3.0L/min的流速淋洗树脂柱，用45%乙醇以1.0L/min的流速冲洗大孔树脂柱，收集洗脱液。通过紫外吸收在线监测收集的提取液。
将所得的洗脱液于50℃、-0.098Mpa条件下浓缩至浓稠膏。将浓稠膏如硅胶进行拌样，之后干燥。监测水分，水分应小于1.0%。
将拌样硅胶样上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱液洗脱，分离样品中的有效成分，样品中的主成分为龙胆苦苷，獐芽菜苦苷及獐芽菜苷，通过硅胶柱分离得到目标产物，浓缩目标产物，用乙醇反复洗涤，于真空下减压干燥，得成品，收率为4.5%。经验证，大孔树脂连续使用5次后需再生一次，可连续使用，使用次数约为50次。
2.6 提取物检测
大孔树酯中残留苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯及乙烯苯，照气相色谱法测定原料药中是否含有苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯及乙烯苯，色谱条件：毛细管柱DM-642，30M×0.53mm，结果本品未检出与苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯及乙烯苯。
照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部附录）测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：水 （30：70） 为流动相；检测波长为254nm。理论板数按龙胆苦苷峰计算，应不低于5000。精密称取龙胆苦苷对照品适量，加流动相制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。精密称取本品适量，加流动相制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照上述方法测定提取物含量，结果含量为99.3%。
取本品适量，用乙腈：水 （20：80） 制成每1ml含1mg的溶液作为供试品溶液，精密量取供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，记录色谱至主成分峰保留时间的3倍，使用二极管阵列检测器监测峰纯度，结果龙胆苦苷主成分峰纯度符合规定，已知杂质为獐芽菜苦苷及獐芽菜苷，二者的杂质量均小于0.1%，其它未知杂质均小于0.1%。
3.结论
为确定所建立的工艺条件是否适合于大生产，使用大生产的设备连续生产10批样品，对所确定的提取、浓缩、分离的工艺参数进行系统的评价并进行验证，工艺验证的结果表明投料量在大生产的条件下所确定的工艺参数稳定性好、所得的原料批间质量无差异，各项检验结果无明显差别，表明工艺稳定、可控、重复性好。
参考文献
[1] 李超，韩泳平.响应面优化龙胆草中龙胆苦苷提取工艺的研究. 西南民族大学学报（自然科学版），2013年3月第29卷第3期：205-207.
[2] 崔长旭，柳明洙，李天洙，张学武.龙胆草水提取物对大鼠急性肝损伤的保护作用.延边大学学报，2005年3月第28卷第1期：20-22.
[3] 金香子，徐明.龙胆草提取物抗炎、镇痛、耐缺氧及抗疲劳作用的研究.时针国医国药，2015年16卷第9期：842-843.
作者简介：潘云峰，男，哈药集团中药二厂，质检化验员。