【摘 要】
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目的构建高滴度大鼠N1ICD慢病毒过表达载体(LV-N1ICD)及N1ICD慢病毒干扰载体(LV-N1ICD-sh RNA)。方法以大鼠c DNA文库为模板,PCR法扩增N1ICD,通过定向克隆构建p GC-FU-N1ICD-
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目的构建高滴度大鼠N1ICD慢病毒过表达载体(LV-N1ICD)及N1ICD慢病毒干扰载体(LV-N1ICD-sh RNA)。方法以大鼠c DNA文库为模板,PCR法扩增N1ICD,通过定向克隆构建p GC-FU-N1ICD-3Flag穿梭质粒;设计4对N1ICD-sh RNA寡核苷酸序列,以构建GVC112-N1ICD-sh RNA干扰质粒,将p GC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-sh RNA共转293T细胞,检测Flag的表达,筛选理想的GVC112-N1ICD-sh RNA干扰质粒。将p GC-FU-N1ICD-3Flag或GVC112-N1ICD-sh RNA与p Helper 1.0、p Helper 2.0共转293T细胞,以包装LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA,分别利用Real-time PCR、药物筛选法进行病毒滴度测定。LV-N1ICD及LV-N1ICD-sh RNA分别感染H9c2心肌细胞,利用CCK-8检测细胞活力。结果 p GC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-sh RNA质粒经PCR、基因测序及Western-blotting验证构建成功,与p Helper 1.0、p Helper 2.0共转293T细胞后,取上清浓缩,分别获得高滴度LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA。LV-N1ICD可明显提高心肌细胞活力,LV-N1ICDsh RNA可降低心肌细胞活力。结论 LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA包装成功,具有Notch1信号通路生物学功能。
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