【摘 要】
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目的简化测定hTNFα及其突变体的受体竞争结合活性的方法.方法将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)前S区(preS1)肽段(2～50)编码区,分别融合于hsTR55和hsTR75基因的C末端组成融合受
【基金项目】
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国家高技术研究发展计划(863计划);
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目的简化测定hTNFα及其突变体的受体竞争结合活性的方法.方法将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)前S区(preS1)肽段(2～50)编码区,分别融合于hsTR55和hsTR75基因的C末端组成融合受体分子基因,并利用细小RNA病毒属脑炎心肌炎病毒EMCV的内核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES),构建了hsTR55/hsTR75以及它们与preS1组成的融合受体分子hsTR55/hsTR75-preS1基因和新霉素抗性(neoR)基因的双顺反子表达载体,转染BHK-21细胞后用G-418持续筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株.结果 RT-PCR及ELISA均证实,两种融合受体分子表达,并且表达上清对hTNFα的活性均具有一定的中和作用.在对表达上清进行ELISA定量后,我们还用Biosensor方法测定了这些可溶性受体分子与hTNFα的结合常数.结果表明,在融合preS1肽段前后,hTNFα与受体分子的解离常数变化不大.结论利用表达的两种融合受体分子,成功地建立了一种检测hTNFα及其突变体的受体竞争结合活性的ELISA法,并利用该法测定了野生型hTNFα及其4种突变体的受体竞争结合活性,所获结果与利用125I-hTNFα测定的结果具有相当的可比性.
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