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基金项目开封市科技攻关项目(110336)
摘要目的：观察反应停联合他莫昔芬对小鼠乳腺癌移植瘤的抑制效应。方法：将小鼠乳腺癌细胞4T1注射到Balb/c小鼠右腹部第二乳房脂肪垫下，1周后，分别用50mg/kg的反应停和25mg/kg的他莫昔芬单独及联合治疗荷瘤小鼠2周，每周2次测量各组小鼠肿瘤体积大小，观察小鼠的体重、摄食量、饮水量。治疗结束后次日，检测小鼠血清VEGF和TNF-α，切除肿瘤称重，并检测小鼠肺转移结节数。结果：反应停联合他莫昔芬能协同抑制小鼠移植瘤的生长，增加荷瘤小鼠摄食量及饮水量，阻止体重下降，降低血清VEGF和TNF-α，减少小鼠肺转移结节数。结论：反应停联合他莫昔芬对小鼠乳腺癌移植瘤有协同治疗作用，其机制可能与降低血清VEGF和TNF-α水平有关。
关键词反应停他莫昔芬乳腺癌
doi:103969/jissn1007-614x201133005
他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)是雌激素受体阳性乳腺癌内分泌治疗的首选药物，但许多乳腺癌患者特别是部分绝经期后的乳腺癌患者由于雌激素受体(ER)表达缺失对TAM不敏感［1］。反应停作为一种血管生成抑制剂，已经在治疗难治性多发性骨髓瘤方面取得良好的效果，新近有临床报道沙利度胺治疗晚期乳腺癌疗效显著［2，3］。因此，推测反应停联合他莫昔芬可能有协同治疗乳腺癌作用。为了验证这个假设，观察了反应停联合他莫昔芬对小鼠乳腺癌的治疗作用。
资料与方法
试剂：反应停片，用时05%的CMC-Na混悬成适当浓度。枸橼酸他莫昔芬片，用时05%的CMC-Na混悬成适当浓度。血管内皮生长因子VEGF和肿瘤坏死因子TNF-αELISA试剂盒。
实验动物及瘤株：BALB/c小鼠，雌性，18～22g；4T1乳腺癌瘤株由中科院生物物理研究所梁伟教授惠赠，本实验室于BABL/c小鼠在体传代保存。
主要仪器：酶标仪：Elx800型，BIO-TEK。
实验方法：①对小鼠4T1乳腺癌自发肺转移的影响：取接种2周生长良好的小鼠4T1乳腺癌组织，用生理盐水研磨制备成5×106个细胞/ml悬液，以01ml/只接种于40只雌性BALB/c小鼠的第二乳房脂肪垫下。接种后1周将小鼠按体重分为4组，每组10只，即模型对照组：每天2次灌胃生理盐水；反应停组：每天灌胃反应停50mg/kg体重，2次；他莫昔芬组：每天灌胃他莫昔芬25mg/kg体重，2次；联合治疗组：每天灌胃反应停50mg/kg+他莫昔芬25mg/kg体重，2次。每天上午9：00和下午5：00给药，各组灌胃容积均为02ml/10g体重，连续给药2周。治疗后用游标卡尺每周测肿瘤直径2次，按公式计算肿瘤体积，肿瘤体积(mm3)=(肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤厚度)，并每周监测小鼠体重、摄食量、饮水量变化判断药物治疗相关毒性。全程治疗结束第2天每组取小鼠采血，处死剥瘤称重，并用10倍放大镜检测肺部各叶肿瘤转移结节数。用ELISA试剂盒测定血清血管内皮生长因子VEGF和肿瘤坏死因子TNF-α。
表1反应停联合他莫昔芬对小鼠4T1乳腺癌的治疗作用(n=10，X±S)
组别剂量(mg/kg·日)
原位肿瘤
重量(g)抑制率(%)
肺转移结节
数目(个)抑制率(%)
对照-246±051-283±64-
他莫昔芬50208±048154276±7125
反应停100238±05332194±68314
他莫昔芬/反应停50/100117±051626102±36640
[BG）F][CSX%0，0，0，40]注：与对照组比较：P＜005，P＜001。[FK）]
[CSX]
表2反应停联合他莫昔芬对4T1乳腺癌荷瘤小鼠动态指标的影响(n=10，X±S)
指标对照他莫昔芬反应停他莫昔芬/反应停
肿瘤体积8天584±103602±108575±114591±115
(mm3)11天1681±1541165±1631491±1621014±192
15天7242±5174813±6376843±6273645±527
18天15263±138510485±153414558±14126847±743
22天28415±322417541±282627684±331510354±2136
体重(g)8天195±14196±15194±14193±15
11天206±15188±20208±20198±16
15天214±16181±21219±21203±18
18天218±18173±24225±22209±20
22天222±20169±25231±22211±22
饮水量(ml)8天34±0832±0935±0933±10
11天35±0825±0836±1031±11
15天37±0923±0838±1134±10
18天38±1022±0740±1135±12
22天40±1020±0842±1236±11
饮食量(g)8天22±0622±0721±0623±07
11天25±0719±0625±0822±08
15天26±0718±0628±0824±07
18天28±0817±0631±0925±08
22天30±0815±0534±1026±09
[BG）F][CSX%0，0，0，40]注：与对照组比较：P＜005，P＜001，饮水量和饮食量是指测量时间段内每只小鼠的日消耗量平均值。[FK）]
[CSX]
表3反应停联合他莫昔芬对4T1乳腺癌荷瘤小鼠血清VEGF和TNF-α的影响(n=10，X±S)
组别剂量(mg/kg·日)VEGF(pg/ml)TNF-α(pg/ml)
对照-1124±106123±38
他莫昔芬501182±115187±45
反应停100552±6162±26
他莫昔芬/反应停50/100763±8291±22
[BG）F][CSX%0，0，0，40]注：与对照组比较：P＜005，P＜001。[FK）][HJ]
[FL（3！@（0，0，0，40）K2]
血清血管内皮生长因子VGEF和肿瘤坏死因子TNF-α检测：收集所选小鼠不抗凝静脉血，离心、分离血清后置-40℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测血清血管内皮生长因子VEGF和肿瘤坏死因子TNF-α含量。
统计学方法：数据以(X±S)表示，组间差异用单向方差分析(ANOVA)，两组间差异用 t检验，经SPSS100进行，P＜005为有统计学差异。
结果
反应停联合他莫昔芬协同阻止小鼠乳腺癌发展：他莫昔芬单独用药对乳腺癌原位肿瘤生长的抑制率仅154%，且小鼠体重下降明显，饮食和饮水量均减少；反应停单独应用虽然小鼠状态良好，但肿瘤生长无减缓，抑制率仅32%；而反应停联合他莫昔芬能明显抑制小鼠乳腺癌发展，对原位肿瘤的生长抑制率524%，对肺转移结节抑制达640%，同时增加荷瘤小鼠摄食量及饮水量，阻止他莫昔芬单独使用引起的荷瘤小鼠体重下降，见表1和表2。
反应停联合他莫昔芬抑制乳腺癌荷瘤小鼠血清VGEF和TNF-α：他莫昔芬单独用药能增加乳腺癌荷瘤小鼠TNF-α，但对血清VEGF无影响；反应停单独应用降低乳腺癌荷瘤小鼠血清VEGF和TNF-α；而反应停联合他莫昔芬也降低乳腺癌荷瘤小鼠血清VEGF和TNF-α，见表3。
讨论
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，已成为威胁女性健康影响女性生存质量的重大疾病之一。以前的研究发现反应停有逆转化疗药物耐药作用［4］，并与化疗药物有协同治疗实体瘤作用［5］，因此推测其可能有与他莫昔芬协同治疗乳腺癌作用。在本研究中，采用雌激素受体阴性小鼠乳腺癌4T1观察了反应停联合他莫昔芬的治疗作用，结果表明反应停联合他莫昔芬有增效减毒作用，可以增加雌激素受体阴性乳腺癌患者的癌细胞对他莫昔芬的敏感性，其机制可能与降低荷瘤小鼠血清VGEF和TNF-α有关，此为临床扩大他莫昔芬治疗乳腺癌提供了一种新方法。
参考文献
1邢风玲,陈雪芹,冯力民,等绝经后服用他莫昔芬的乳腺癌患者子宫内膜中PTEN的表达［J］首都医科大学学报,2010,31(3):405
2李书芹,孙国锋,赵卫红TP方案联合沙利度胺治疗晚期乳腺癌［J］临床医学,2009,29(1):74
3赵斌沙利度胺联合治疗晚期乳腺癌的临床观察［J］中外医疗,2009,12:97
4杨义明,杜钢军,林海红,等反应停对HL-60细胞马利兰耐药的逆转作用［J］郑州大学学报(医学版),2005,40(2):3005杜钢军,林海红,许启泰,等反应停的抗新生血管形成及抗肿瘤作用研究［J］中国药理学通报,2005,21(4):4714
摘要目的：观察反应停联合他莫昔芬对小鼠乳腺癌移植瘤的抑制效应。方法：将小鼠乳腺癌细胞4T1注射到Balb/c小鼠右腹部第二乳房脂肪垫下，1周后，分别用50mg/kg的反应停和25mg/kg的他莫昔芬单独及联合治疗荷瘤小鼠2周，每周2次测量各组小鼠肿瘤体积大小，观察小鼠的体重、摄食量、饮水量。治疗结束后次日，检测小鼠血清VEGF和TNF-α，切除肿瘤称重，并检测小鼠肺转移结节数。结果：反应停联合他莫昔芬能协同抑制小鼠移植瘤的生长，增加荷瘤小鼠摄食量及饮水量，阻止体重下降，降低血清VEGF和TNF-α，减少小鼠肺转移结节数。结论：反应停联合他莫昔芬对小鼠乳腺癌移植瘤有协同治疗作用，其机制可能与降低血清VEGF和TNF-α水平有关。
关键词反应停他莫昔芬乳腺癌
doi:103969/jissn1007-614x201133005
他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)是雌激素受体阳性乳腺癌内分泌治疗的首选药物，但许多乳腺癌患者特别是部分绝经期后的乳腺癌患者由于雌激素受体(ER)表达缺失对TAM不敏感［1］。反应停作为一种血管生成抑制剂，已经在治疗难治性多发性骨髓瘤方面取得良好的效果，新近有临床报道沙利度胺治疗晚期乳腺癌疗效显著［2，3］。因此，推测反应停联合他莫昔芬可能有协同治疗乳腺癌作用。为了验证这个假设，观察了反应停联合他莫昔芬对小鼠乳腺癌的治疗作用。
资料与方法
试剂：反应停片，用时05%的CMC-Na混悬成适当浓度。枸橼酸他莫昔芬片，用时05%的CMC-Na混悬成适当浓度。血管内皮生长因子VEGF和肿瘤坏死因子TNF-αELISA试剂盒。
实验动物及瘤株：BALB/c小鼠，雌性，18～22g；4T1乳腺癌瘤株由中科院生物物理研究所梁伟教授惠赠，本实验室于BABL/c小鼠在体传代保存。
主要仪器：酶标仪：Elx800型，BIO-TEK。
实验方法：①对小鼠4T1乳腺癌自发肺转移的影响：取接种2周生长良好的小鼠4T1乳腺癌组织，用生理盐水研磨制备成5×106个细胞/ml悬液，以01ml/只接种于40只雌性BALB/c小鼠的第二乳房脂肪垫下。接种后1周将小鼠按体重分为4组，每组10只，即模型对照组：每天2次灌胃生理盐水；反应停组：每天灌胃反应停50mg/kg体重，2次；他莫昔芬组：每天灌胃他莫昔芬25mg/kg体重，2次；联合治疗组：每天灌胃反应停50mg/kg+他莫昔芬25mg/kg体重，2次。每天上午9：00和下午5：00给药，各组灌胃容积均为02ml/10g体重，连续给药2周。治疗后用游标卡尺每周测肿瘤直径2次，按公式计算肿瘤体积，肿瘤体积(mm3)=(肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤厚度)，并每周监测小鼠体重、摄食量、饮水量变化判断药物治疗相关毒性。全程治疗结束第2天每组取小鼠采血，处死剥瘤称重，并用10倍放大镜检测肺部各叶肿瘤转移结节数。用ELISA试剂盒测定血清血管内皮生长因子VEGF和肿瘤坏死因子TNF-α。
表1反应停联合他莫昔芬对小鼠4T1乳腺癌的治疗作用(n=10，X±S)
组别剂量(mg/kg·日)
原位肿瘤
重量(g)抑制率(%)
肺转移结节
数目(个)抑制率(%)
对照-246±051-283±64-
他莫昔芬50208±048154276±7125
反应停100238±05332194±68314
他莫昔芬/反应停50/100117±051626102±36640
[BG）F][CSX%0，0，0，40]注：与对照组比较：P＜005，P＜001。[FK）]
[CSX]
表2反应停联合他莫昔芬对4T1乳腺癌荷瘤小鼠动态指标的影响(n=10，X±S)
指标对照他莫昔芬反应停他莫昔芬/反应停
肿瘤体积8天584±103602±108575±114591±115
(mm3)11天1681±1541165±1631491±1621014±192
15天7242±5174813±6376843±6273645±527
18天15263±138510485±153414558±14126847±743
22天28415±322417541±282627684±331510354±2136
体重(g)8天195±14196±15194±14193±15
11天206±15188±20208±20198±16
15天214±16181±21219±21203±18
18天218±18173±24225±22209±20
22天222±20169±25231±22211±22
饮水量(ml)8天34±0832±0935±0933±10
11天35±0825±0836±1031±11
15天37±0923±0838±1134±10
18天38±1022±0740±1135±12
22天40±1020±0842±1236±11
饮食量(g)8天22±0622±0721±0623±07
11天25±0719±0625±0822±08
15天26±0718±0628±0824±07
18天28±0817±0631±0925±08
22天30±0815±0534±1026±09
[BG）F][CSX%0，0，0，40]注：与对照组比较：P＜005，P＜001，饮水量和饮食量是指测量时间段内每只小鼠的日消耗量平均值。[FK）]
[CSX]
表3反应停联合他莫昔芬对4T1乳腺癌荷瘤小鼠血清VEGF和TNF-α的影响(n=10，X±S)
组别剂量(mg/kg·日)VEGF(pg/ml)TNF-α(pg/ml)
对照-1124±106123±38
他莫昔芬501182±115187±45
反应停100552±6162±26
他莫昔芬/反应停50/100763±8291±22
[BG）F][CSX%0，0，0，40]注：与对照组比较：P＜005，P＜001。[FK）][HJ]
[FL（3！@（0，0，0，40）K2]
血清血管内皮生长因子VGEF和肿瘤坏死因子TNF-α检测：收集所选小鼠不抗凝静脉血，离心、分离血清后置-40℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测血清血管内皮生长因子VEGF和肿瘤坏死因子TNF-α含量。
统计学方法：数据以(X±S)表示，组间差异用单向方差分析(ANOVA)，两组间差异用 t检验，经SPSS100进行，P＜005为有统计学差异。
结果
反应停联合他莫昔芬协同阻止小鼠乳腺癌发展：他莫昔芬单独用药对乳腺癌原位肿瘤生长的抑制率仅154%，且小鼠体重下降明显，饮食和饮水量均减少；反应停单独应用虽然小鼠状态良好，但肿瘤生长无减缓，抑制率仅32%；而反应停联合他莫昔芬能明显抑制小鼠乳腺癌发展，对原位肿瘤的生长抑制率524%，对肺转移结节抑制达640%，同时增加荷瘤小鼠摄食量及饮水量，阻止他莫昔芬单独使用引起的荷瘤小鼠体重下降，见表1和表2。
反应停联合他莫昔芬抑制乳腺癌荷瘤小鼠血清VGEF和TNF-α：他莫昔芬单独用药能增加乳腺癌荷瘤小鼠TNF-α，但对血清VEGF无影响；反应停单独应用降低乳腺癌荷瘤小鼠血清VEGF和TNF-α；而反应停联合他莫昔芬也降低乳腺癌荷瘤小鼠血清VEGF和TNF-α，见表3。
讨论
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，已成为威胁女性健康影响女性生存质量的重大疾病之一。以前的研究发现反应停有逆转化疗药物耐药作用［4］，并与化疗药物有协同治疗实体瘤作用［5］，因此推测其可能有与他莫昔芬协同治疗乳腺癌作用。在本研究中，采用雌激素受体阴性小鼠乳腺癌4T1观察了反应停联合他莫昔芬的治疗作用，结果表明反应停联合他莫昔芬有增效减毒作用，可以增加雌激素受体阴性乳腺癌患者的癌细胞对他莫昔芬的敏感性，其机制可能与降低荷瘤小鼠血清VGEF和TNF-α有关，此为临床扩大他莫昔芬治疗乳腺癌提供了一种新方法。
参考文献
1邢风玲,陈雪芹,冯力民,等绝经后服用他莫昔芬的乳腺癌患者子宫内膜中PTEN的表达［J］首都医科大学学报,2010,31(3):405
2李书芹,孙国锋,赵卫红TP方案联合沙利度胺治疗晚期乳腺癌［J］临床医学,2009,29(1):74
3赵斌沙利度胺联合治疗晚期乳腺癌的临床观察［J］中外医疗,2009,12:97
4杨义明,杜钢军,林海红,等反应停对HL-60细胞马利兰耐药的逆转作用［J］郑州大学学报(医学版),2005,40(2):3005杜钢军,林海红,许启泰,等反应停的抗新生血管形成及抗肿瘤作用研究［J］中国药理学通报,2005,21(4):4714