【摘 要】
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目的 构建固有免疫调控蛋白--双链RNA(dsRNA)调控的蛋白激酶(PKR)的串联亲和纯化系统(TAP),初步研究PKR蛋白功能,以用于与PKR相互作用的新蛋白的鉴定与功能分析.方法 通过PCR
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目的 构建固有免疫调控蛋白--双链RNA(dsRNA)调控的蛋白激酶(PKR)的串联亲和纯化系统(TAP),初步研究PKR蛋白功能,以用于与PKR相互作用的新蛋白的鉴定与功能分析.方法 通过PCR扩增PKR目的基因,克隆至真核表达载体pcTAP-A中.将重组质粒pcTAP-PKR通过脂质体法转染PKR稳定沉默(PKRkd)的HeLa细胞,并检测PKR对固有免疫信号通路之一,即促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)激活的调控;最后利用串联亲和纯化试剂盒纯化分离与PKR相互作用的蛋白,验证PKR蛋白复合物的纯化情况.结果 将重组质粒pcTAP-PKR转染PKRkd HeLa细胞后,24 h后即可检测到PKR融合蛋白,相对分子质量约为75×103,其表达量随着转染时间的增加而减少;PKR的过表达可发生自我磷酸化,并引起了MAPK信号通路的激活;Western blot结果显示,小规模TAP纯化试验成功分离纯化了PKR蛋白.结论 成功建立了一个PKR表达和串联亲和纯化系统,并证明PKR具有调控MAPK信号通路活性,为今后鉴定与PKR相互作用的蛋白研究奠定了基础.
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