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摘 要：以具有肉质根的未知白菜材料‘14-16’及芸薹种内其他有/无肉质根的类型为研究对象，利用分子标记探究几类蔬菜特别是具有肉质根的‘14-16’白菜材料与其他芸薹种蔬菜的亲缘关系。UPGMA 聚类结果表明：遗传相似系数为0.62时，15份材料分为2类，第1类均为无肉质根类型；‘14-16’与有肉质根的芜菁和薹菜归为第2大类，但亲缘关系有一定距离。普通白菜‘黄渡矮青菜’和大白菜‘北京新三号’也属于第2类，说明芸薹种内肉质根类型材料的遗传组成有一定的相似性，但也存在复杂性。
关键词：芸薹种；肉质根；亲缘关系
中图分类号 S634 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）07-0009-04
Abstract：In this study，the unknown material ‘14-16’ with fleshy roots and other types of Brassica campestris L. with/without fleshy roots were used as research materials to explore the relationship between these vegetables，especially the ‘14-16’ and other vegetables with fleshy root. The results of UPGMA clustering showed that when the genetic similarity coefficient was 0.62，15 materials were divided into two categories，and the first group was no fleshy root type；‘14-16’ is classified as the second group with turnips and Tai-tsai，they all have fleshy roots.Pakchoi 'Huangdu' and Chinese Cabbage ‘Beijing New 3’ also belong to the second category. The above results indicate that the genetic composition of the fleshy root type materials in the alfalfa species has certain similarities，but there are also complexities.
Key words：Brassica compestris L.；Fleshy root；Genetic relationship
常见的芜菁、萝卜等具有肉质根的蔬菜多为耐寒或半耐寒蔬菜[1]。芸薹种的薹菜在华北地区能够露地越冬，研究者认为其抗寒性与越冬前形成的肉质根有关[2]。笔者在资源收集中发现了少见的具有肉质根的不结球类型白菜材料‘14-16’，叶片具少量毛刺，叶形似大白菜叶，其能在青岛地区连续2年露地越冬，并于春天返青。而一般的白菜类蔬菜根系虽然发达，但不具肉质根，如果没有保温设施，基本无法在山东半岛地区内越冬。因此，‘14-16’在肉质根性状遗传和抗冻性育种方面具有重要的研究价值，但目前仍不清晰其遗传关系。芸薹种分子标记的研究开展较早[3，4]，研究结果均表明，种内具有丰富的遗传多样性，而针对芸薹种内肉质根蔬菜亲缘关系及肉质根形成相关的标记的研究报道目前仍较少。为此，本研究以具有肉质根的‘14-16’为主要研究对象，利用分子标记手段，通过与具肉质根的芜菁、薹菜及无肉质根的普通白菜等芸薹种蔬菜进行种内的遗传比较，分析几种蔬菜的亲缘关系，特别是‘四季小白菜’与其他芸薹种肉质根蔬菜的亲缘关系，为探究芸薹种肉质根蔬菜的亲缘关系提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料 试验选取15分材料，包括不具肉质根的3份大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis Olsson）、4份普通白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. communis Tsen et Lee）、2份乌塌菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee），能够形成肉质根的3份薹菜（Brassica campestris L.ssp. Chinensis（L.）Makino var. tai-tsai Hort）、2份芜菁（Brassica campestris L. ssp. rapi fera Matzg）和不结球的白菜材料‘14-16’。材料名称、来源肉质根性状见表1。
1.2 DNA提取和检测 15份试验材料于2018年4月6日播种在青岛市城阳区青岛农业大学实验基地。5月10日，对每个材料选择3～4个单株的嫩叶混合取样，采用CTAB法提取基因組DNA。用0.7%～1%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计（美国Thermo NanoDrop 2000）进行DNA质量、纯度和浓度检测，将基因组DNA浓度稀释至50ng/μL，-20℃保存。
1.3 引物合成 本试验前期以乌塌菜‘小八叶’ב平度薹菜’的4个回交后代自交系及2个亲本为材料对芸薹属基因组数据库（http：//brassicadb.org/brad/index.php）中的325对引物进行了鉴定，从中选择了49对扩增条带清晰、可重复、具有多态性的引物用于本次试验。引物由青岛擎科生物科技有限公司合成，引物位置及序列信息见表2。 1.4 PCR扩增及检测 PCR反应总体系为20μL，包含10×PCR Buffer（含25mmol/L MgCl2）2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq 酶0.2μL，模板DNA（50ng/μL）1.0μL，上下游引物各1.0μL（10μmol/μL），ddH2O 14.4μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。PCR扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离检测，180V、130mA条件下，电泳100min。用银染显色法检测电泳结果。
1.5 数据统计 选择清晰可辨的电泳条带，以1和0记录多态片段的有和无，在同一位置上出现的电泳条带记为“1”，同一位置没有出现的带记为“0”，以获得矩阵。采用NTSYSpc（2.1e版）软件分析供试材料的遗传相似系数，采用非加权平均法（UPGMA）进行聚类分析并绘图[5]。
2 结果与分析
本试验对49对引物的扩增产物进行了聚丙烯凝胶电泳，引物覆盖6条染色体，15个材料共获得99条谱带，其中89条具有多态性，多态性比率为89.89%。每条引物扩增出2～6条清晰条带，扩增结果见图1。
根据引物的检测结果，通过UPGMA方法聚类分析后得到供试材料的聚类图（图2）。群体的遗传相似性系数介于0.48～0.83，表明15个材料间存在较大的遗传差异。当相似系数在0.62时，15个材料分为两大类。第1类均为无肉质根的材料，包括3份普通白菜、2份乌塌菜和2份大白菜。第2类包括有肉质根的3份薹菜、2份芜菁和未知的‘14-16’材料，还包括无肉质根的大白菜‘北京新3号’、普通白菜‘黄渡矮青菜’。在第2大类中，材料‘14-16’（9号）单独列为一类，与其他材料在遗传关系上有一定距离。在所有15个材料中，‘14-16’与‘金黄蔓菁’相似系数最高，为0.72，与第1大类中的‘新夏青5号’相似系数最低（0.55），其次为‘金夏莳’（0.56）。以上结果可以看出，具有肉质根性状的芸薹种白菜，与无肉质根的类型在遗传关系上存在一定距离。
3 结论与讨论
本研究利用来源于芸薹属数据库中的标记引物分析了未知白菜材料‘14-16’与芸薹种蔬菜中具有肉质根和不具有肉质根的代表类型之间的遗传关系。结果显示，具有肉质根的材料在聚类关系中均归于一类，与无肉质根的芸薹种类型具有一定的遗传差异。说明在肉质根性状上来源于白菜基因组的引物能较好地反映芸薹种群体的遗传组成。在聚类图中，“黄渡矮青菜”和“北京新3号”虽无明显肉质根形成，但仍与肉质根类型划分为同一大类，推测可能与它们的遗传来源不同有关。在后期的研究中，应进一步扩大引物在染色体组上的分布范围，并增加不同类型测试材料的数量，以获得更精确的聚类结果。
参考文献
[1]罗丹，吴委林，周波，等.芜菁SSR引物的开发及多态性分析[J].生物技术通讯，2012，23（03）：402-406.
[2]刘倩倩，孙艳，刘维信，等.薹菜肉质根发育过程中糖积累及蔗糖代谢相关酶活性变化[J].植物生理学报，2016，52（11）：1546-1544.
[3]李光光，黄红弟，张华，等.利用SSR分子标记研究白菜类亚种资源的遗传多样性[J].热带作物学报，2017，38（07）：1316-1322.
[4]劉冬媛，王新华，刘杨，等.不结球白菜品种（系）遗传多样性与亲缘关系的SSR分析[J].分子植物育种，2014，12（03）：499-508.
[5]李桂花，陈汉才，张艳，等.小白菜种质遗传多样性与亲缘关系的SRAP和SSR分析[J].广东农业科学，2017，44（05）：37-45.
（责编：张宏民）
关键词：芸薹种；肉质根；亲缘关系
中图分类号 S634 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）07-0009-04
Abstract：In this study，the unknown material ‘14-16’ with fleshy roots and other types of Brassica campestris L. with/without fleshy roots were used as research materials to explore the relationship between these vegetables，especially the ‘14-16’ and other vegetables with fleshy root. The results of UPGMA clustering showed that when the genetic similarity coefficient was 0.62，15 materials were divided into two categories，and the first group was no fleshy root type；‘14-16’ is classified as the second group with turnips and Tai-tsai，they all have fleshy roots.Pakchoi 'Huangdu' and Chinese Cabbage ‘Beijing New 3’ also belong to the second category. The above results indicate that the genetic composition of the fleshy root type materials in the alfalfa species has certain similarities，but there are also complexities.
Key words：Brassica compestris L.；Fleshy root；Genetic relationship
常见的芜菁、萝卜等具有肉质根的蔬菜多为耐寒或半耐寒蔬菜[1]。芸薹种的薹菜在华北地区能够露地越冬，研究者认为其抗寒性与越冬前形成的肉质根有关[2]。笔者在资源收集中发现了少见的具有肉质根的不结球类型白菜材料‘14-16’，叶片具少量毛刺，叶形似大白菜叶，其能在青岛地区连续2年露地越冬，并于春天返青。而一般的白菜类蔬菜根系虽然发达，但不具肉质根，如果没有保温设施，基本无法在山东半岛地区内越冬。因此，‘14-16’在肉质根性状遗传和抗冻性育种方面具有重要的研究价值，但目前仍不清晰其遗传关系。芸薹种分子标记的研究开展较早[3，4]，研究结果均表明，种内具有丰富的遗传多样性，而针对芸薹种内肉质根蔬菜亲缘关系及肉质根形成相关的标记的研究报道目前仍较少。为此，本研究以具有肉质根的‘14-16’为主要研究对象，利用分子标记手段，通过与具肉质根的芜菁、薹菜及无肉质根的普通白菜等芸薹种蔬菜进行种内的遗传比较，分析几种蔬菜的亲缘关系，特别是‘四季小白菜’与其他芸薹种肉质根蔬菜的亲缘关系，为探究芸薹种肉质根蔬菜的亲缘关系提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料 试验选取15分材料，包括不具肉质根的3份大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis Olsson）、4份普通白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. communis Tsen et Lee）、2份乌塌菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee），能够形成肉质根的3份薹菜（Brassica campestris L.ssp. Chinensis（L.）Makino var. tai-tsai Hort）、2份芜菁（Brassica campestris L. ssp. rapi fera Matzg）和不结球的白菜材料‘14-16’。材料名称、来源肉质根性状见表1。
1.2 DNA提取和检测 15份试验材料于2018年4月6日播种在青岛市城阳区青岛农业大学实验基地。5月10日，对每个材料选择3～4个单株的嫩叶混合取样，采用CTAB法提取基因組DNA。用0.7%～1%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计（美国Thermo NanoDrop 2000）进行DNA质量、纯度和浓度检测，将基因组DNA浓度稀释至50ng/μL，-20℃保存。
1.3 引物合成 本试验前期以乌塌菜‘小八叶’ב平度薹菜’的4个回交后代自交系及2个亲本为材料对芸薹属基因组数据库（http：//brassicadb.org/brad/index.php）中的325对引物进行了鉴定，从中选择了49对扩增条带清晰、可重复、具有多态性的引物用于本次试验。引物由青岛擎科生物科技有限公司合成，引物位置及序列信息见表2。 1.4 PCR扩增及检测 PCR反应总体系为20μL，包含10×PCR Buffer（含25mmol/L MgCl2）2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq 酶0.2μL，模板DNA（50ng/μL）1.0μL，上下游引物各1.0μL（10μmol/μL），ddH2O 14.4μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。PCR扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离检测，180V、130mA条件下，电泳100min。用银染显色法检测电泳结果。
1.5 数据统计 选择清晰可辨的电泳条带，以1和0记录多态片段的有和无，在同一位置上出现的电泳条带记为“1”，同一位置没有出现的带记为“0”，以获得矩阵。采用NTSYSpc（2.1e版）软件分析供试材料的遗传相似系数，采用非加权平均法（UPGMA）进行聚类分析并绘图[5]。
2 结果与分析
本试验对49对引物的扩增产物进行了聚丙烯凝胶电泳，引物覆盖6条染色体，15个材料共获得99条谱带，其中89条具有多态性，多态性比率为89.89%。每条引物扩增出2～6条清晰条带，扩增结果见图1。
根据引物的检测结果，通过UPGMA方法聚类分析后得到供试材料的聚类图（图2）。群体的遗传相似性系数介于0.48～0.83，表明15个材料间存在较大的遗传差异。当相似系数在0.62时，15个材料分为两大类。第1类均为无肉质根的材料，包括3份普通白菜、2份乌塌菜和2份大白菜。第2类包括有肉质根的3份薹菜、2份芜菁和未知的‘14-16’材料，还包括无肉质根的大白菜‘北京新3号’、普通白菜‘黄渡矮青菜’。在第2大类中，材料‘14-16’（9号）单独列为一类，与其他材料在遗传关系上有一定距离。在所有15个材料中，‘14-16’与‘金黄蔓菁’相似系数最高，为0.72，与第1大类中的‘新夏青5号’相似系数最低（0.55），其次为‘金夏莳’（0.56）。以上结果可以看出，具有肉质根性状的芸薹种白菜，与无肉质根的类型在遗传关系上存在一定距离。
3 结论与讨论
本研究利用来源于芸薹属数据库中的标记引物分析了未知白菜材料‘14-16’与芸薹种蔬菜中具有肉质根和不具有肉质根的代表类型之间的遗传关系。结果显示，具有肉质根的材料在聚类关系中均归于一类，与无肉质根的芸薹种类型具有一定的遗传差异。说明在肉质根性状上来源于白菜基因组的引物能较好地反映芸薹种群体的遗传组成。在聚类图中，“黄渡矮青菜”和“北京新3号”虽无明显肉质根形成，但仍与肉质根类型划分为同一大类，推测可能与它们的遗传来源不同有关。在后期的研究中，应进一步扩大引物在染色体组上的分布范围，并增加不同类型测试材料的数量，以获得更精确的聚类结果。
参考文献
[1]罗丹，吴委林，周波，等.芜菁SSR引物的开发及多态性分析[J].生物技术通讯，2012，23（03）：402-406.
[2]刘倩倩，孙艳，刘维信，等.薹菜肉质根发育过程中糖积累及蔗糖代谢相关酶活性变化[J].植物生理学报，2016，52（11）：1546-1544.
[3]李光光，黄红弟，张华，等.利用SSR分子标记研究白菜类亚种资源的遗传多样性[J].热带作物学报，2017，38（07）：1316-1322.
[4]劉冬媛，王新华，刘杨，等.不结球白菜品种（系）遗传多样性与亲缘关系的SSR分析[J].分子植物育种，2014，12（03）：499-508.
[5]李桂花，陈汉才，张艳，等.小白菜种质遗传多样性与亲缘关系的SRAP和SSR分析[J].广东农业科学，2017，44（05）：37-45.
（责编：张宏民）