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摘要 [目的]建立柱前衍生高效液相色谱法测定植物油中黄曲霉毒素B1含量的方法。[方法]样品甲醇水溶液（45+55）、三氯甲烷提取浓缩之后，用苯乙腈（2+98）溶解，三氟乙酸衍生，反相C18柱分离，荧光检测器检测，所用激发及发射波长依次为365、440 nm。[结果]试验表明，黄曲霉毒素B1线性关系良好，对添加黄曲霉毒素B1的样品进行加标回收试验，回收率在89.5%，重复性试验相对标准偏差（n=6）为2.34%。[结论]该法操作简单、线性范围广、效果良好，可用于测定植物油中黄曲霉毒素B1的含量。
关键词 黄曲霉毒素B1；高效液相色谱；柱前衍生；植物油
中图分类号 S609.9 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）26-09180-01
Determination of Aflatoxin B1 in Vegetable Oil by HPLC with Pre-column Derivatization
FENG Min-xian et al （Liuzhou Product Quality Supervision and Inspection Institute， Liuzhou， Guangxi 545006）
Abstract [Objective] To establish the method for determining aflatoxin B1 in vegetable oil by pre-column derivatization with HPLC. [Method] Aqueous methanol （45+55） and chloroform after extraction and concentration， were dissolved in benzene acetonitrile （2+98）， derived from trifluoroacetic acid， separated by reversed phase C18 column and detected by fluorescence detector， excitation and emission wavelengths were 365 and 440 nm. [Result] The results showed that aflatoxin B1 has a good linear relationship， spiked recovery test was conducted on samples with aflatoxin B1， recovery rate was 89.5%， repeatability relative standard deviation （n=6） is 2.34%. [Conclusion] The method is simple， and has wide linear range and good effect， which can be used for determination of aflatoxin B1 in vegetable oil.
Key words Aflatoxin B1； HPLC； Pre-column derivatization； Vegetable oil
黃曲霉毒素是黄曲霉和寄生虫产生的一组结构类似的代谢产物，具有极强的毒性，被世界卫生组织定为1类致癌物质[1]。黄曲霉毒素广泛存在于粮油制品中，尤其以黄曲霉毒素B1为多。为了控制食品中黄曲霉毒素的含量，目前世界各国都规定了其在植物油中的最大限量，国家标准GB2761-2011规定了花生油黄曲霉毒素 B1的含量不大于20 μg/kg，其他植物油为10～20 μg/kg。
目前国际上测定黄曲霉毒素B1常见的方法有薄层层析法（TLC）[2]、酶联免疫分析法（ELIAS）[3]、高效液相色谱法配柱后衍生系统[4]。薄层层析法，其步骤多，测定时间长，干扰因素多，试剂耗费大，灵敏度低，荧光强度的目测精确性较差，特异性不强且安全性较差，主要用于半定量测定。酶联免疫分析法其灵敏度高，特异性强，分析速度较快，其缺点主要在于影响因素较多，容易出现假阳性造成误判。高效液相色谱法分离能力强，灵敏度高，特异性好，其检测结果可靠。
国家标准采用TLC和HPLC（配柱后衍生系统）测定植物油黄曲霉毒素B1的含量，TLC中采用紫外点样分析方法，在荧光检测下观察蓝色的荧光点，此法检出限高，且偏差较大。因此，建立一种快速检测植物油中黄曲霉毒素B1的方法是十分必要的。
1 材料与方法
1.1 材料 供试6种植物油分别为大豆油1、大豆油2、花生调和油1、花生油1、花生调和油2、花生油2。岛津LC-20AT高效液相色谱仪，配有荧光检测器，氮吹仪，恒温培养箱，漩涡混合器。主要试剂：黄曲霉毒素B1标准品（国家标准物质中心），甲醇（色谱级），乙腈（色谱级），三氟乙酸（分析纯），水（三级用水），石油醚（分析纯），三氯甲烷（分析纯）。
1.2 方法
1.2.1 提取。称取10 g（0.01 kg）样品、加30 ml石油醚（60～90 ℃沸程）溶解，转入分液漏斗中，加30 ml甲醇水（45+55）分数次洗涤烧杯，一并倒入分液漏斗中，摇匀，静置数分钟；把下层液体转入另一个分液漏斗中，加30 ml三氯甲烷，摇匀，静置分层，收集下层溶液，挥发近干，加1.5 ml苯-乙腈溶解定容，待衍生。 1.2.2 衍生。取上述溶液200 μl加200 μl三氟乙酸衍生，漩涡后，放入50 ℃恒温干燥箱中衍生5 min，氮吹仪吹干，用流动相定容1 ml，经0.45 μm滤膜过滤，待上机。
1.2.3 色谱条件。色谱柱：C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈水（13+75）∶甲醇=75∶25；检测波长：激发波长365 mm，发射波长440 mm；进样量10 μl；流速1.0 ml/min。
1.2.4 标准溶液配制。标准品浓度为1 μg/ml，体积1 ml，用苯乙腈定容至5 ml，得0.2 μg/ml标准使用液。分别取50、100、200、400、800 μl衍生，氮吹仪吹干，定容1 ml，得进样浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μg/ml。
2 结果与分析
2.1 流动相的选择
在研究选用不同比例的流动相，采用NY/T1286-2007标准第8.3.2条为甲醇∶水∶乙腈=13∶75∶12，色谱峰在18 min出峰，且峰形宽大、不对称。经多次研究发现，采用乙腈水比例固定，甲醇比例高，能缩短出峰时间，且色谱峰形尖锐、对称，图1～3为标准品和样品的色谱图。由图1、3可看出，甲醇∶（乙腈+水）比例为20∶（78+12）时，标准品和样品在9.6 min出峰。
2.2 衍生方式的选择
由于黄曲霉毒素B1具有荧光强度特性，在TLC方法中浓度较高的标准品具有较强的荧光强度，可以在紫外点样分析仪看出，微弱的荧光强度则无法判断且容易被杂质造成干扰。但可以用液相色谱仪检出，需要对样品进行衍生，用于加强黄曲霉毒素B1的荧光强度。目前衍生的方法有柱前衍生和柱后衍生，柱前衍生法主要有三氟乙酸衍生法和盐酸衍生法。该试验中采用的是柱前衍生方法，对衍生剂的用量，衍生时间、衍生温度做了考察，结果在衍生剂200 μl，50 ℃，衍生5 min条件下，可取得较好的重现性和准确度。
2.3 重复性试验
准确称取植物油样品1（大豆油1），分别按照“1.2”
试验方法进行提取衍生，再进行液相色谱分析。对黄曲霉毒素B1峰面积的重现性进行分析，结果峰面积的RSD（n=6）为2.34%，表明该方法的重复性较好。
2.4 精密度试验
精密吸取标准品溶液10 μl，重复进样6次，在相同色谱条件下分析其峰面积。结果峰面积的RSD为1.38%，表明该方法的精密度良好。
2.5 回收率试验 对未检出的植物油加入标准品后，测定黄曲霉毒素B1含量并计算加标回收率，结果见表1。
2.6 6种植物油中黄曲霉毒素B1含量的检测 供试6种植物油经提取、浓缩、衍生之后，检测结果如下：大豆油1、大豆油2、花生调和油1、花生油1、花生调和油2、花生油2中的黄曲霉毒素B1含量依次为0.02、0.34、1.46、5.49、2.34、4.89 μg/kg。
3 结论
该试验建立了一种测定植物油中黄曲霉毒素B1的分析方法，样品经提取、浓缩、衍生，结果可靠，干扰因素小，减少了薄层层析法中用肉眼来判断而带来的误差，方法准确度较高、专属性较强，可为植物油中黄曲霉毒素的监管提供技术支持。
参考文献
[1]IARC-WHO.Some naturally occurring substances：Food items and constituents， heterocyclic aromatic amines，and mycotoxins. IARC monograps on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans[J].Lyon France，1993，56：245-362.
[2] 柳洁，何壁英.高效液相色谱法测定食品中黄曲霉毒素的方法研究[J].现代预防医学，2002，29（2）：137-140.
[3] 刘冬儿.酶联免疫吸附分析法测定食品中的黄曲霉毒素B1[J].包装与机械，2002，23（10）：78-89.
[4] 祝偉霞，杨冀州，袁萍，等.高效液相色谱法测定3种植物油中4种黄曲霉毒素含量[J].理化检验-化学分册，2013，49（8）：981-984.
[5] 柳其芳.酶联免疫吸附法和薄层色谱法联合分析黄曲霉毒素B1的研究[J].中国热带医学，2006，6（2）：246-248.
关键词 黄曲霉毒素B1；高效液相色谱；柱前衍生；植物油
中图分类号 S609.9 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）26-09180-01
Determination of Aflatoxin B1 in Vegetable Oil by HPLC with Pre-column Derivatization
FENG Min-xian et al （Liuzhou Product Quality Supervision and Inspection Institute， Liuzhou， Guangxi 545006）
Abstract [Objective] To establish the method for determining aflatoxin B1 in vegetable oil by pre-column derivatization with HPLC. [Method] Aqueous methanol （45+55） and chloroform after extraction and concentration， were dissolved in benzene acetonitrile （2+98）， derived from trifluoroacetic acid， separated by reversed phase C18 column and detected by fluorescence detector， excitation and emission wavelengths were 365 and 440 nm. [Result] The results showed that aflatoxin B1 has a good linear relationship， spiked recovery test was conducted on samples with aflatoxin B1， recovery rate was 89.5%， repeatability relative standard deviation （n=6） is 2.34%. [Conclusion] The method is simple， and has wide linear range and good effect， which can be used for determination of aflatoxin B1 in vegetable oil.
Key words Aflatoxin B1； HPLC； Pre-column derivatization； Vegetable oil
黃曲霉毒素是黄曲霉和寄生虫产生的一组结构类似的代谢产物，具有极强的毒性，被世界卫生组织定为1类致癌物质[1]。黄曲霉毒素广泛存在于粮油制品中，尤其以黄曲霉毒素B1为多。为了控制食品中黄曲霉毒素的含量，目前世界各国都规定了其在植物油中的最大限量，国家标准GB2761-2011规定了花生油黄曲霉毒素 B1的含量不大于20 μg/kg，其他植物油为10～20 μg/kg。
目前国际上测定黄曲霉毒素B1常见的方法有薄层层析法（TLC）[2]、酶联免疫分析法（ELIAS）[3]、高效液相色谱法配柱后衍生系统[4]。薄层层析法，其步骤多，测定时间长，干扰因素多，试剂耗费大，灵敏度低，荧光强度的目测精确性较差，特异性不强且安全性较差，主要用于半定量测定。酶联免疫分析法其灵敏度高，特异性强，分析速度较快，其缺点主要在于影响因素较多，容易出现假阳性造成误判。高效液相色谱法分离能力强，灵敏度高，特异性好，其检测结果可靠。
国家标准采用TLC和HPLC（配柱后衍生系统）测定植物油黄曲霉毒素B1的含量，TLC中采用紫外点样分析方法，在荧光检测下观察蓝色的荧光点，此法检出限高，且偏差较大。因此，建立一种快速检测植物油中黄曲霉毒素B1的方法是十分必要的。
1 材料与方法
1.1 材料 供试6种植物油分别为大豆油1、大豆油2、花生调和油1、花生油1、花生调和油2、花生油2。岛津LC-20AT高效液相色谱仪，配有荧光检测器，氮吹仪，恒温培养箱，漩涡混合器。主要试剂：黄曲霉毒素B1标准品（国家标准物质中心），甲醇（色谱级），乙腈（色谱级），三氟乙酸（分析纯），水（三级用水），石油醚（分析纯），三氯甲烷（分析纯）。
1.2 方法
1.2.1 提取。称取10 g（0.01 kg）样品、加30 ml石油醚（60～90 ℃沸程）溶解，转入分液漏斗中，加30 ml甲醇水（45+55）分数次洗涤烧杯，一并倒入分液漏斗中，摇匀，静置数分钟；把下层液体转入另一个分液漏斗中，加30 ml三氯甲烷，摇匀，静置分层，收集下层溶液，挥发近干，加1.5 ml苯-乙腈溶解定容，待衍生。 1.2.2 衍生。取上述溶液200 μl加200 μl三氟乙酸衍生，漩涡后，放入50 ℃恒温干燥箱中衍生5 min，氮吹仪吹干，用流动相定容1 ml，经0.45 μm滤膜过滤，待上机。
1.2.3 色谱条件。色谱柱：C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈水（13+75）∶甲醇=75∶25；检测波长：激发波长365 mm，发射波长440 mm；进样量10 μl；流速1.0 ml/min。
1.2.4 标准溶液配制。标准品浓度为1 μg/ml，体积1 ml，用苯乙腈定容至5 ml，得0.2 μg/ml标准使用液。分别取50、100、200、400、800 μl衍生，氮吹仪吹干，定容1 ml，得进样浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μg/ml。
2 结果与分析
2.1 流动相的选择
在研究选用不同比例的流动相，采用NY/T1286-2007标准第8.3.2条为甲醇∶水∶乙腈=13∶75∶12，色谱峰在18 min出峰，且峰形宽大、不对称。经多次研究发现，采用乙腈水比例固定，甲醇比例高，能缩短出峰时间，且色谱峰形尖锐、对称，图1～3为标准品和样品的色谱图。由图1、3可看出，甲醇∶（乙腈+水）比例为20∶（78+12）时，标准品和样品在9.6 min出峰。
2.2 衍生方式的选择
由于黄曲霉毒素B1具有荧光强度特性，在TLC方法中浓度较高的标准品具有较强的荧光强度，可以在紫外点样分析仪看出，微弱的荧光强度则无法判断且容易被杂质造成干扰。但可以用液相色谱仪检出，需要对样品进行衍生，用于加强黄曲霉毒素B1的荧光强度。目前衍生的方法有柱前衍生和柱后衍生，柱前衍生法主要有三氟乙酸衍生法和盐酸衍生法。该试验中采用的是柱前衍生方法，对衍生剂的用量，衍生时间、衍生温度做了考察，结果在衍生剂200 μl，50 ℃，衍生5 min条件下，可取得较好的重现性和准确度。
2.3 重复性试验
准确称取植物油样品1（大豆油1），分别按照“1.2”
试验方法进行提取衍生，再进行液相色谱分析。对黄曲霉毒素B1峰面积的重现性进行分析，结果峰面积的RSD（n=6）为2.34%，表明该方法的重复性较好。
2.4 精密度试验
精密吸取标准品溶液10 μl，重复进样6次，在相同色谱条件下分析其峰面积。结果峰面积的RSD为1.38%，表明该方法的精密度良好。
2.5 回收率试验 对未检出的植物油加入标准品后，测定黄曲霉毒素B1含量并计算加标回收率，结果见表1。
2.6 6种植物油中黄曲霉毒素B1含量的检测 供试6种植物油经提取、浓缩、衍生之后，检测结果如下：大豆油1、大豆油2、花生调和油1、花生油1、花生调和油2、花生油2中的黄曲霉毒素B1含量依次为0.02、0.34、1.46、5.49、2.34、4.89 μg/kg。
3 结论
该试验建立了一种测定植物油中黄曲霉毒素B1的分析方法，样品经提取、浓缩、衍生，结果可靠，干扰因素小，减少了薄层层析法中用肉眼来判断而带来的误差，方法准确度较高、专属性较强，可为植物油中黄曲霉毒素的监管提供技术支持。
参考文献
[1]IARC-WHO.Some naturally occurring substances：Food items and constituents， heterocyclic aromatic amines，and mycotoxins. IARC monograps on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans[J].Lyon France，1993，56：245-362.
[2] 柳洁，何壁英.高效液相色谱法测定食品中黄曲霉毒素的方法研究[J].现代预防医学，2002，29（2）：137-140.
[3] 刘冬儿.酶联免疫吸附分析法测定食品中的黄曲霉毒素B1[J].包装与机械，2002，23（10）：78-89.
[4] 祝偉霞，杨冀州，袁萍，等.高效液相色谱法测定3种植物油中4种黄曲霉毒素含量[J].理化检验-化学分册，2013，49（8）：981-984.
[5] 柳其芳.酶联免疫吸附法和薄层色谱法联合分析黄曲霉毒素B1的研究[J].中国热带医学，2006，6（2）：246-248.