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【摘 要】目的：比较体外培养纯化星形胶质细胞的不同方法对星形胶质细胞影响，为进一步研究奠定基础。方法：原代培养后分别经振荡纯化、传代纯化的方法培养星形胶质细胞。结果：原代培养的星形胶质细胞纯度不高；经振荡纯化后GFAP表达量明显增多，GFAP免疫荧光变亮；经传代纯化培养后纯度达到97%，GFAP表达量较少。结论：经过传代纯化的星形胶质细胞纯度较高，GFAP表达量较少，因此能更好地反映其在脑中的功能，是研究星形胶质细胞在脑中的功能较好的培养方法。
【关键词】星形胶质细胞；体外培养；胶质纤维酸性蛋白
【中图分类号】R-311 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）06-3494-01
【Abstract】Objective： Comparing different ways of isolation and purify astrocytes from mouse cerebral tissue to Learn the effect of astrocytes for future study of their functions in the brain. Methods： To acquire purified astrocytes by two usually used cultural methods： after primary culture， subculture for three times or shanken overnight twice. Results： The purity of primary culture was the lowest ，with the method of being shanken over night twice highly expressed GFAP， Immunofluorescence staining with anti-mouse GFAP was brighter. Astrocytes purified by being subcultured for three times over 97% purity. The expression of by GFAP low. Conclusion： With the subcultural method we can acquire the purer astrocytes in vitro， which the expression of by GFAP lower， and can best reflect their functions in the brain. It’s an optimal method to acquire the astrocytes for future study of their functions in vivo.
【Key words】astrocyte； in vitro； glial fibrillary acidic protein
反應性星形胶质细胞及星形胶质细胞与神经元的关系一直以来都是神经科学界关注的热门课题[1]，体外分离纯化星形胶质细胞己有三十余年的历史，为众多研究提供了实验基础，也大大促进了对Ast的特性研究。虽然获取星形胶质细胞的方法较多，但一般研究偏重星形胶质细胞的纯度而较少关注其生物学特性。而不同的体外培养方法可能影响Ast活化，表现为GFAP不同程度的表达，进而可能影响实验结果，本研究将文献常报道的两种方法进行比较，观察不同试验方法对GFAP表达影响，从而获得一种纯度既高，又能满足不同实验要求的星形胶质细胞纯化方法。
1 材料与方法
1.1 材料 SD乳鼠（泰山医学院实验动物中心）；DMEM/F12粉剂（Gibco产品）；兔抗人GFAP多克隆抗体（北京中杉金桥）；Cy3标记抗兔IgG免疫荧光试剂盒（碧云天生物技术研究所）；细胞核染色剂DAPI（碧云天生物技术研究所）； Image-proplus4.0图像分析系统（IPP公司）。
1.2方法
1.2.1 星形胶质细胞纯化培养 选用SPF级、出生时间不超过48 h的健康SD乳鼠，75%乙醇浸泡消毒后，处死、取出大脑移入含有预冷的D-Hank’s液培养皿中，洗涤并去除脑膜，夹取少许大脑皮层组织D-Hank’s液中洗涤、剪碎，0.125%胰蛋白酶消化后终止，过滤、离心，弃上清，重新加入培养基，制成单细胞悬液，接种到培养瓶中，差速粘附处理2次。再次制成单细胞悬液，接种至预先用多聚赖氨酸包被过的培养瓶中， 37℃、5%CO2培养箱培养， 7～9 d后，细胞已80% ～90%融合，进行传代培养。
1.2.2 传代培养时按以下两种方法进行星形胶质细胞培养： （1）培养10～12 d，在摇床上以180 r/min振荡过夜一次（DMEM基培， 37°C，18 h）， 隔天再以同样的方法振荡第二次，此为 “振荡纯化”；以后每4 d传一代（不再做震荡纯化），共传三次，每次传代不做差速贴壁，实验取传三代（即第四代）的星形胶质细胞，终密度为1×106/ml左右，于传代后7 d进行实验。 （2）原代培养（3d换液一次）第12天开始，每4 d传一代，共传三次，每次传代均差速贴壁0. 5 h，实验取传三代（即第四代）的星形胶质细胞，终密度为1×106/ml左右，于传代后7 d进行实验，此为“传代纯化”。
1.2.3 星形胶质细胞鉴定 将盖玻片置于六孔培养板内，种入不同方法纯化的Ast传代培养3代的细胞，每种方法12个标本，待细胞长至约为50%～80%满，4%多聚甲醛固定，洗涤；加入封闭液封闭60 min，洗涤；用稀释50倍兔抗人GFAP一抗作用60 min，去除一抗，洗涤3次，每次5 min；加入1毫升稀释500倍的Cy3标记的IgG二抗，避光作用60 min，洗涤后加入1 ml浓度为1μg.ml-1 的DAPI，避光作用30 min，洗涤后加一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，在荧光显微镜下观察到红色的荧光及蓝色荧光分别为GEAP染色与核染色。每个标本随机取3个视野，分别计数红色及蓝色荧光个数，以红色/蓝色百分比表示纯化纯度，取平均值记录。 1.2.4 细胞GFAP表达的检测 接种24h后，4%多聚甲醛固定，洗涤；加入封闭液封闭60 min，洗涤3次，每次5 min；用稀释50倍兔抗人GFAP一抗作用60 min，洗涤加入稀释500倍Cy3标记的IgG二抗，避光作用60 min，洗涤（同上）；滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片。在荧光显微镜下（200倍），每个标本随机取3个视野，用图像采集处理系统记录每个视野的荧光强度值，以平均荧光强度值表示该标本的GFAP表达相对水平。
1.3统计学方法 应用SAS8.1统计软件进行数据分析，计量资料实验数据采用均数±标准差（ ）表示。两变量采用t检验，P <0.05认为差异有统计学意义。
2结果
传代后，星形胶质细胞胞体较大而扁，形状不规则，胞质较丰富，细胞核圆形或卵圆形，常偏于胞体的一侧，内有1～2个核仁，经GFAP特异性标记抗体的免疫荧光染色以及DAPI染色后，荧光显微镜观察可见：两种培养方法特异性染色的GFAP亮度不同，但统计分析示：GFAP阳性细胞率震荡纯化为（98.3±0.9）%、传代纯化为（97.0±1.1）%（P > 0.05），（见图1，图2）。提示不同的培养方法对Ast的纯化没有影响。
3讨论
在中枢神经系统中，胶质细胞是主要的组成部分，其中星形胶质细胞（Ast）在中枢神经系统中发挥着多种作用。在受到一定程度的刺激时，星形胶质细胞会表现出胞体变大，突触变长，交织成网的“反应性星形胶质细胞”的形态特征，并伴随着一系列功能改变，包括胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增强，而GFAP免疫反应增强表明Ast被活化。相对于在体研究，体外分离培养的Ast具有许多优点：Ast分离、纯化培养比较容易，在培养基中生长稳定，不容易发生自发转化，保持了在体情况下的生理功能和对外界因素刺激的良好反应性；纯化培养的Ast既无神经元存在，又消除了在体情况下各种因素对Ast的影响，Ast对损伤的反应基本干扰因素也比较容易控制，有利于进行机制研究的单因素分析。因此，采用體外培养的方法对Ast进行研究就成为神经科学研究者致力的一个方向。如何获取高纯度的星形胶质细胞，并且使其在正常离体培养过程中不被诱导为反应性星形胶质细胞，是研究其在脑内功能的前提。本研究将对文献常报道的两种方法进行观察、比较。
原代培养时，我们尽量选用刚出生的乳鼠，一般不超过48小时，此时脑皮质的Ast处于分裂增殖的高峰期，培养细胞易于成活；取材时在解剖显微镜下务求尽量去除脑膜和血管。这样即可以提高Ast的成活力，还可以有效预防成纤维细胞、血细胞、内皮细胞的污染；有文献报道最主要污染的细胞为贴附能力很强的成纤维细胞与小胶质细胞[2]，只有通过反复的传代和预贴壁才能有效除去， 我们的实验是在“原代培养”的基础上，继续传代培养。
传代时，我们采用不同的方法，观察对GFAP表达的影响，在“震荡纯化”传代培养中，以200 r/min的速率在恒温震荡器上作用后酶消化传代。与直接酶消化法相比，经恒温震荡后，可以有效地除去少突胶质细胞[3] ，因为少突胶质细胞呈半粘附状态附着于星形胶质细胞之上，通过震荡可以去除，增加胶质细胞的纯化率。同时也避免了采用柱过滤的方法对星形胶质细胞的损伤[4] ，传代后，纯化获得的星形胶质细胞其反应性标志物GFAP的表达量大量增加， GFAP免疫荧光亮度增高，提示细胞已经处于“活化”阶段。在“传代纯化”的方法中，我们也获得较为纯化的星形胶质细胞，传三代后的星形胶质细胞纯度可达97%，两种传代培养方法所获得的星形胶质细胞纯度没有统计学意义。但与“震荡纯化”相比：其GFAP荧光强度值明显降低（p<0.01），提示传代纯化对星形胶质细胞活化影响较低。有利于在离体的研究中观察星形胶质细胞的功能变化。
总之，用“传代纯化”获取星形胶质细胞能有效去除其他细胞的污染，达到97%以上的纯度，对某些对GFAP表达或星形胶质细胞活化有特除要求的离体研究，可提供满足实验要求的纯化星形胶质细胞株。
参考文献
[1] Sheng J， Yang S， Xu L， et al， Bystin as a novel marke for reactive astrocytes in the adult rat brain following injury[J]. Eur JNeurosci， 2004， 20（4）： 873-884.
[2] Tabernero A， Orfao A， Medina JM. Astrocyte differentiation in primary culture followed by flow cytometry[J].Neurosci Res， 1996， 24（2）： 131-138.
[3] Glub M S， Han B， Keen C L. Aluminum uptake and effects on transferring mediated iron uptake in primary cultures of rat neurons， Astrocytes and oligodendrocytes [ J ].Neurotoxicology， 1999， 20（6）： 961-970
[4.] Schneider B， Mutel V， Pietri M，et al. NADPH oxidase and extracelluar-regulated kinases 1/2 are targets of prion protein signaling in neuronal and nonneuronal cells[J]. PNAS， 2003， 100：13326-13331.
【关键词】星形胶质细胞；体外培养；胶质纤维酸性蛋白
【中图分类号】R-311 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）06-3494-01
【Abstract】Objective： Comparing different ways of isolation and purify astrocytes from mouse cerebral tissue to Learn the effect of astrocytes for future study of their functions in the brain. Methods： To acquire purified astrocytes by two usually used cultural methods： after primary culture， subculture for three times or shanken overnight twice. Results： The purity of primary culture was the lowest ，with the method of being shanken over night twice highly expressed GFAP， Immunofluorescence staining with anti-mouse GFAP was brighter. Astrocytes purified by being subcultured for three times over 97% purity. The expression of by GFAP low. Conclusion： With the subcultural method we can acquire the purer astrocytes in vitro， which the expression of by GFAP lower， and can best reflect their functions in the brain. It’s an optimal method to acquire the astrocytes for future study of their functions in vivo.
【Key words】astrocyte； in vitro； glial fibrillary acidic protein
反應性星形胶质细胞及星形胶质细胞与神经元的关系一直以来都是神经科学界关注的热门课题[1]，体外分离纯化星形胶质细胞己有三十余年的历史，为众多研究提供了实验基础，也大大促进了对Ast的特性研究。虽然获取星形胶质细胞的方法较多，但一般研究偏重星形胶质细胞的纯度而较少关注其生物学特性。而不同的体外培养方法可能影响Ast活化，表现为GFAP不同程度的表达，进而可能影响实验结果，本研究将文献常报道的两种方法进行比较，观察不同试验方法对GFAP表达影响，从而获得一种纯度既高，又能满足不同实验要求的星形胶质细胞纯化方法。
1 材料与方法
1.1 材料 SD乳鼠（泰山医学院实验动物中心）；DMEM/F12粉剂（Gibco产品）；兔抗人GFAP多克隆抗体（北京中杉金桥）；Cy3标记抗兔IgG免疫荧光试剂盒（碧云天生物技术研究所）；细胞核染色剂DAPI（碧云天生物技术研究所）； Image-proplus4.0图像分析系统（IPP公司）。
1.2方法
1.2.1 星形胶质细胞纯化培养 选用SPF级、出生时间不超过48 h的健康SD乳鼠，75%乙醇浸泡消毒后，处死、取出大脑移入含有预冷的D-Hank’s液培养皿中，洗涤并去除脑膜，夹取少许大脑皮层组织D-Hank’s液中洗涤、剪碎，0.125%胰蛋白酶消化后终止，过滤、离心，弃上清，重新加入培养基，制成单细胞悬液，接种到培养瓶中，差速粘附处理2次。再次制成单细胞悬液，接种至预先用多聚赖氨酸包被过的培养瓶中， 37℃、5%CO2培养箱培养， 7～9 d后，细胞已80% ～90%融合，进行传代培养。
1.2.2 传代培养时按以下两种方法进行星形胶质细胞培养： （1）培养10～12 d，在摇床上以180 r/min振荡过夜一次（DMEM基培， 37°C，18 h）， 隔天再以同样的方法振荡第二次，此为 “振荡纯化”；以后每4 d传一代（不再做震荡纯化），共传三次，每次传代不做差速贴壁，实验取传三代（即第四代）的星形胶质细胞，终密度为1×106/ml左右，于传代后7 d进行实验。 （2）原代培养（3d换液一次）第12天开始，每4 d传一代，共传三次，每次传代均差速贴壁0. 5 h，实验取传三代（即第四代）的星形胶质细胞，终密度为1×106/ml左右，于传代后7 d进行实验，此为“传代纯化”。
1.2.3 星形胶质细胞鉴定 将盖玻片置于六孔培养板内，种入不同方法纯化的Ast传代培养3代的细胞，每种方法12个标本，待细胞长至约为50%～80%满，4%多聚甲醛固定，洗涤；加入封闭液封闭60 min，洗涤；用稀释50倍兔抗人GFAP一抗作用60 min，去除一抗，洗涤3次，每次5 min；加入1毫升稀释500倍的Cy3标记的IgG二抗，避光作用60 min，洗涤后加入1 ml浓度为1μg.ml-1 的DAPI，避光作用30 min，洗涤后加一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，在荧光显微镜下观察到红色的荧光及蓝色荧光分别为GEAP染色与核染色。每个标本随机取3个视野，分别计数红色及蓝色荧光个数，以红色/蓝色百分比表示纯化纯度，取平均值记录。 1.2.4 细胞GFAP表达的检测 接种24h后，4%多聚甲醛固定，洗涤；加入封闭液封闭60 min，洗涤3次，每次5 min；用稀释50倍兔抗人GFAP一抗作用60 min，洗涤加入稀释500倍Cy3标记的IgG二抗，避光作用60 min，洗涤（同上）；滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片。在荧光显微镜下（200倍），每个标本随机取3个视野，用图像采集处理系统记录每个视野的荧光强度值，以平均荧光强度值表示该标本的GFAP表达相对水平。
1.3统计学方法 应用SAS8.1统计软件进行数据分析，计量资料实验数据采用均数±标准差（ ）表示。两变量采用t检验，P <0.05认为差异有统计学意义。
2结果
传代后，星形胶质细胞胞体较大而扁，形状不规则，胞质较丰富，细胞核圆形或卵圆形，常偏于胞体的一侧，内有1～2个核仁，经GFAP特异性标记抗体的免疫荧光染色以及DAPI染色后，荧光显微镜观察可见：两种培养方法特异性染色的GFAP亮度不同，但统计分析示：GFAP阳性细胞率震荡纯化为（98.3±0.9）%、传代纯化为（97.0±1.1）%（P > 0.05），（见图1，图2）。提示不同的培养方法对Ast的纯化没有影响。
3讨论
在中枢神经系统中，胶质细胞是主要的组成部分，其中星形胶质细胞（Ast）在中枢神经系统中发挥着多种作用。在受到一定程度的刺激时，星形胶质细胞会表现出胞体变大，突触变长，交织成网的“反应性星形胶质细胞”的形态特征，并伴随着一系列功能改变，包括胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增强，而GFAP免疫反应增强表明Ast被活化。相对于在体研究，体外分离培养的Ast具有许多优点：Ast分离、纯化培养比较容易，在培养基中生长稳定，不容易发生自发转化，保持了在体情况下的生理功能和对外界因素刺激的良好反应性；纯化培养的Ast既无神经元存在，又消除了在体情况下各种因素对Ast的影响，Ast对损伤的反应基本干扰因素也比较容易控制，有利于进行机制研究的单因素分析。因此，采用體外培养的方法对Ast进行研究就成为神经科学研究者致力的一个方向。如何获取高纯度的星形胶质细胞，并且使其在正常离体培养过程中不被诱导为反应性星形胶质细胞，是研究其在脑内功能的前提。本研究将对文献常报道的两种方法进行观察、比较。
原代培养时，我们尽量选用刚出生的乳鼠，一般不超过48小时，此时脑皮质的Ast处于分裂增殖的高峰期，培养细胞易于成活；取材时在解剖显微镜下务求尽量去除脑膜和血管。这样即可以提高Ast的成活力，还可以有效预防成纤维细胞、血细胞、内皮细胞的污染；有文献报道最主要污染的细胞为贴附能力很强的成纤维细胞与小胶质细胞[2]，只有通过反复的传代和预贴壁才能有效除去， 我们的实验是在“原代培养”的基础上，继续传代培养。
传代时，我们采用不同的方法，观察对GFAP表达的影响，在“震荡纯化”传代培养中，以200 r/min的速率在恒温震荡器上作用后酶消化传代。与直接酶消化法相比，经恒温震荡后，可以有效地除去少突胶质细胞[3] ，因为少突胶质细胞呈半粘附状态附着于星形胶质细胞之上，通过震荡可以去除，增加胶质细胞的纯化率。同时也避免了采用柱过滤的方法对星形胶质细胞的损伤[4] ，传代后，纯化获得的星形胶质细胞其反应性标志物GFAP的表达量大量增加， GFAP免疫荧光亮度增高，提示细胞已经处于“活化”阶段。在“传代纯化”的方法中，我们也获得较为纯化的星形胶质细胞，传三代后的星形胶质细胞纯度可达97%，两种传代培养方法所获得的星形胶质细胞纯度没有统计学意义。但与“震荡纯化”相比：其GFAP荧光强度值明显降低（p<0.01），提示传代纯化对星形胶质细胞活化影响较低。有利于在离体的研究中观察星形胶质细胞的功能变化。
总之，用“传代纯化”获取星形胶质细胞能有效去除其他细胞的污染，达到97%以上的纯度，对某些对GFAP表达或星形胶质细胞活化有特除要求的离体研究，可提供满足实验要求的纯化星形胶质细胞株。
参考文献
[1] Sheng J， Yang S， Xu L， et al， Bystin as a novel marke for reactive astrocytes in the adult rat brain following injury[J]. Eur JNeurosci， 2004， 20（4）： 873-884.
[2] Tabernero A， Orfao A， Medina JM. Astrocyte differentiation in primary culture followed by flow cytometry[J].Neurosci Res， 1996， 24（2）： 131-138.
[3] Glub M S， Han B， Keen C L. Aluminum uptake and effects on transferring mediated iron uptake in primary cultures of rat neurons， Astrocytes and oligodendrocytes [ J ].Neurotoxicology， 1999， 20（6）： 961-970
[4.] Schneider B， Mutel V， Pietri M，et al. NADPH oxidase and extracelluar-regulated kinases 1/2 are targets of prion protein signaling in neuronal and nonneuronal cells[J]. PNAS， 2003， 100：13326-13331.