【摘 要】
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Chemerin是由脂肪组织分泌的脂肪因子,可以调节脂肪细胞的代谢和免疫应答等生物学过程.本研究以鸡(Gallus gallus)肝脏组织总RNA为模板,采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法获得鸡的Chemerin基因全长cDNA序列,应用qPCR检测鸡Chemerin基因mRNA在不同组织中的表达情况;构建Chemerin-Myc真核融合表达载体并转染L
【机 构】
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常熟理工学院生物与食品工程学院,常熟215500
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Chemerin是由脂肪组织分泌的脂肪因子,可以调节脂肪细胞的代谢和免疫应答等生物学过程.本研究以鸡(Gallus gallus)肝脏组织总RNA为模板,采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法获得鸡的Chemerin基因全长cDNA序列,应用qPCR检测鸡Chemerin基因mRNA在不同组织中的表达情况;构建Chemerin-Myc真核融合表达载体并转染LMH(Leghorn male hepatoma)细胞,用Western blot检测Chemerin-Myc融合蛋白表达情况;通过启动子片段截短实验,构建双荧光素酶报告基因载体,检测鸡Chemerin基因不同长度启动子片段的转录效率.结果表明,成功克隆鸡Chemerin基因,其cDNA全长为733 bp,编码162个氨基酸,其中5\'UTR长度为55 bp,3\'UTR长度为189 bp;Chemerin基因主要在肝脏、肾脏和脂肪组织中表达;成功构建真核融合表达载体pCMV-3Tag-9-gga-chemerin-Myc,转染鸡LMH细胞后,经Western blot检测发现,成功实现Chemerin和Myc的融合表达;构建的pGL3b-chemerin-F1/F2/F3/F4四个报告基因载体均显示荧光素酶活性比对照组极显著增加(P<0.01),F1和F3启动子中段的转录效率最高,pGL3b-chemerin-F1中的KLF5(Kruppel-like factor 5)结合位点定点突变后,pGL3b-chemerin-mutF1的荧光素酶活性极其显著降低(P<0.001),在LMH细胞中干扰KLF5表达基因后,Chemerin基因的表达量极显著下降(P<0.01),初步证明在鸡Chemerin基因启动子区F1片段中存在正调控因子KLF5结合的顺式元件.本研究为进一步探讨鸡的Chemerin基因的功能提供了基础资料.
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