证实去甲斑蝥素(NCTD)具抗肾间质纤维化的作用,其抗肾间质纤维化的机制与靶向抑制蛋白磷酸酶2Ac(PP2Ac)对Smad3中间连接区(Smad3-L)的去磷酸化修饰有关。
方法常规培养人肾小管上皮细胞(HK-2),转染PP2Ac shRNA质粒后,细胞分为5组:(1)空白组;(2)TGF-β1(5 μg/L)组;(3)TGF-β1+NCTD(2.5 mg/L)组;(4)TGF-β1+PP2Ac shRNA组;(5)TGF-β1+PP2Ac shRNA+NCTD组。采用实时荧光定量PCR和Western印迹检测PP2Ac、纤维连接蛋白(FN)、胶原蛋白I(Col-I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏蛋白(E-cadherin) mRNA及蛋白的表达。然后将HK-2细胞随机分为3组:(1)空白组;(2)TGF-β1组;(3)TGF-β1+NCTD组,采用免疫荧光检测pSmad3-L(Ser204)和pSmad3-L(Ser208)在HK-2细胞的分布,Western印迹检测HK-2细胞核蛋白pSmad3-L(Ser204)和pSmad3-L(Ser208)的表达。
结果(1)TGF-β1促进HK-2细胞PP2Ac表达,同时上调FN、Col-I和α-SMA的表达,下调E-cadherin的表达。NCTD和PP2Ac shRNA均抑制PP2Ac的表达,下调FN、Col-I和α-SMA表达,上调E-cadherin的表达。但NCTD与小干扰RNA共同作用对PP2Ac表达的抑制,以及对TGF-β1诱导的上述指标的改变程度同单纯PP2Ac小干扰RNA干预组无明显差异。(2)TGF-β1刺激HK-2细胞核内pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)表达明显增多,NCTD干预使pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)在细胞核内表达进一步增多。
结论NCTD通过抑制PP2Ac介导的Smad3-L区去磷酸化,发挥抗肾间质纤维化作用。